شناسایی جرم کلامیدوفیلا آبورتوس

به گزارش «سرویس دام، طیور و آبزیان» «ماکی دام - پایگاه خبری صنعت دام، طیور و آبزیان»؛ اساساً تشخیص موارد مثبت آلودگی با کلامیدوفیلا آبورتوس، بستگی دارد به سابقه سقط در گوسفند یا بز (اغلب در اواخرآبستنی)، التهاب نکروتیک جفت و وجود تعداد بالای ارگانیسم در گسترش‌های رنگ‌آمیزی شده از نمونه جفت آلوده.

برای نمونه‌برداری می‌توان از پشم جنین‌هایی که رطوبت خود را هنوز ازدست نداده‌اند یا سوآب واژن دام‌های ماده‌ای که به تازگی سقط کرده‌اند، استفاده نمود.

باید دقت نمود تا کوتیلودون‌هایی که در اثر آلودگی به کلامیدوفیلا آبورتوس آسیب دیده‌اند را با جراحات ناشی از توکسوپلاسما گوندیی اشتباه نگیریم. همچنین در بررسی‌های خود باید مراقب شباهت‌های ساختاری بین کلامیدوفیلا آبورتوس و کوکسیلا بورنتی (عامل تب کیو) باشیم.

آنتی‌ژن کلامیدیا را می‌توان با روش‌هایی چون الایزا، ایمونوهیستوشیمی یا آزمون فلئورسنت آنتی‌بادی شناسایی کرد، درحالی‌که DNA این باکتری با روش‌هایی چون PCR یا میکرواری (ریز ارابه) قابل شناسایی می‌باشد.

کیت‌های تجاری برخی از این روش‌ها موجود است.

کلامیدوفیلا آبورتوس را تنها می‌توان از سلول‌های زنده جداسازی نمود، بنابراین باید امکان رشد این باکتری در جنین جوجه یا کشت سلولی (با رعایت اصول ایمنی مربوط به نمونه‌های خطرناک) را فراهم آورد.

1) تهیه گسترش

در مواردی که بر اساس سابقه گله و شکل جراحات جفت، مشکوک به سقط آنزئوتیک می‌شویم، می‌توانیم با بررسی میکروسکوپی، از گسترشی که رنگ‌آمیزی کرده‌ایم، جهت تشخیص استفاده نماییم.

برای تهیه گسترش باید از بخش‌های آلوده پرز‌های پرده‌های جنینی یا قسمت‌های مجاور آن استفاده نمود. روش‌های مختلف رنگ‌آمیزی وجود دارد، برای مثال می‌توان به ماکیاولو اصلاح شده، brucella differential، یا زیل نیلسن بهبودیافته اشاره کرد.

هنگامی‌که با روش اخیر رنگ‌آمیزی کرده و سپس با استفاده از یک میکروسکوپ قوی، گسترش تهیه شده را مورد بررسی قرار می‌دهیم، در صورت مثبت بودن نتیجه، تعداد زیادی اجسام اولیه، کوچک nm) 300) و کوکسی شکل را به‌صورت انفرادی یا گروهی و به رنگ قرمز در زمینه آبی مشاهده خواهیم کرد.

در یک زمینه تیره روشن، اجسام اولیه به رنگ سبز روشن مشاهده می‌شوند.

اگر جفت آلوده جهت تهیه گسترش در دسترس نباشد می‌توان گسترش را از سوآب واژن دام‌های ماده‌ای که طی 24 ساعت گذشته سقط کرده‌اند، پشم مرطوب جنین سقط شده یا نوزاد مرده به دنیا آمده (که توسط مادرش تمیز نشده باشد)، محتویات شیردان جنین سقط شده یا نوزاد مرده به دنیا آمده تهیه نمود.

اما به‌طورکلی در این نمونه‌ها تعداد کم‌تری ارگانیسم نسبت به جفت وجود دارد. ازلحاظ ریخت‌شناسی ممکن است تفریق کلامیدوفیلا آبورتوس به‌دلیل شباهت با کوکسیلا بورنتی (عامل تب کیو در انسان) و ریکتزیا مشکل باشد چراکه این باکتری‌ها نیز گاهی باعث سقط می‌شوند.

بنابراین در مواقعی که سابقه مناسبی از گله در اختیار ما قرار ندارد یا زمانی که جراحات پاتولوژیک بر روی جفت مشاهده نمی‌شود، در تفریق موارد فوق باید دقت بیشتری به کار ببریم.

تفاوت‌های آنتی‌ژنیکی بین کلامیدوفیلا آبورتوس و کوکسیلا بورنتی را می‌توان با استفاده از روش‌های سرم‌شناسی تشخیص داد.

برای تشخیص کلامیدوفیلا آبورتوس در گسترش‌هایی که تهیه کرده ایم می‌توان از آزمون فلئورسنت آنتی‌بادی (که در آن آنتی‌سرم اختصاصی یا آنتی‌بادی مونوکلونال به‌کار برده می‌شود) استفاده نمود.

2) شناسایی آنتی‌ژن

آزمون‌های مختلفی که بر اساس شناسایی آنتی‌ژن طراحی شده‌اند، برای تشخیص جنس‌های مختلف کلامیدیا به‌صورت تجاری وجود دارند. در یک ارزیابی مقایسه‌ای که بر روی نمونه‌های غیر گوسفندی انجام شد، مشخص گردید که روش الایزا حساسیت بیشتری نسبت به آزمایش فلئورسنت آنتی‌بادی دارد.

همچنین کیتی که لیپوپلی ساکارید (LPS) کلامیدیا را شناسایی می‌کند نسبت به روش‌های مبتنی بر الایزا بیشترین حساسیت را دارا می‌‌باشد، بنابراین گاهی باعث ایجاد نتایج مثبت کاذب (مخصوصاً در نمونه مدفوع پرندگان) می‌گردد.

این کیت در نمونه‌های جفت گوسفند نتایج رضایت‌بخشی را در اختیار ما قرار می‌دهد. البته باید توجه نمود که با این روش نمی‌توان کلامیدوفیلا آبورتوس را از سایر گونه‌های کلامیدیا که ممکن است نمونه را آلوده کرده باشند تفریق کرد.

در مقاطع هیستوپاتولوژی جهت شناسایی آنتی ژن می‌توان از آنتی‌بادی‌های ضد کلامیدیا که بر ضد LPS یا MOMP (پروتئین بزرگ غشاء خارجی) بوده و به‌صورت تجاری موجود هستند استفاده نمود.

DNA (3

تکثیر DNA کلامیدیا با روش‌های PCR و real-time PCR امکان‌پذیر بوده و با استفاده از این روش‌ها می‌‌توان حضور کلامیدیا را در نمونه‌های بیولوژیک بدون نیاز به کشت دادن تأیید نمود.

PCR حساسیت بالایی دارد اما خطر آلودگی‌های متقاطع بین نمونه‌ها یا آلودگی‌های محیطی در دامداری وجود دارد. یک مشکل بالقوه دیگر ایجاد نتایج منفی کاذب ناشی از مواد مهارکننده در PCR می‌باشد.

روش‌هایی برای تفریق بین توالی‌های DNA ناشی از کلامیدوفیلا آبورتوس و c.pecorum وجود دارد. در سال‌های اخیر استفاده از روش real-time PCR به‌دلیل سرعت بیشتر، توان بالا و سهولت ترجیح داده می‌شود.

اخیراً، روش DNA microarray hybridization که در آن از تیوب‌های اری با کف ضخیم (پلت فرم) استفاده می‌شود، می‌تواند در تشخیص مستقیم و شناسایی ارگانیسم در نمونه‌های بالینی به کار گرفته شود.

آزمون  PCR با قطعات محدود چند شکلی  موجود است که با این روش می‌توان دام‌های آلوده را با دام‌های واکسینه تفکیک کرد.

4) مقاطع بافتی

می‌توان در یک مقطع نازک بافتی (کمتر 4 میکرومتر) که با مایعاتی چون بیون (bouin) یا carnoy به‌خوبی ثابت شده است گنجیدگی‌های داخل سلولی کلامیدیا را با رنگ‌آمیزی گیمسا مشاهده نمود.

همچنین با استفاده از رنگ‌آمیزی‌های ایمنی‌شناسی، نتایج خوبی را می‌توان بدست آورد. آزمون ایمونوپراکسیداز مستقیم، روش سریع و آسانی است، در حالی که آزمون استرپتاویدین - بیوتین یک روش پیچیده است.

استفاده از میکروسکوپ الکترونی با ایجاد کانتراست منفی، می‌تواند کلامیدوفیلا آبورتوس و کوکسیلا بورنتی را از یکدیگر تفریق کند.

5) جداسازی جرم کلامیدیوز

کلامیدوفیلا آبورتوس را می‌توان از تخم‌مرغ‌های جنین‌دار یا در کشت سلولی جداسازی نمود، روش اخیر، روش انتخابی برای جداسازی سویه‌های جدید محسوب می‌شود. از آنجا که عامل کلامیدیوز باعث ایجاد بیماری مشترک با انسان می‌شود، در جداسازی و به‌کارگیری روش‌های تشخیصی لازم است اصول ایمنی در سطح 2 به‌کار گرفته شود.

می‌توان از نمونه‌های بافتی چون کوتیلودون‌ها، غشا‌های جفت، ریه یا کبد جنین یا سوآب واژن استفاده نمود.

چنانچه پس از نمونه‌گیری جداسازی جرم با تأخیر صورت گیرد، برای نگهداری موقت نمونه‌ها باید از محیط‌های انتقالی مناسب استفاده نمود. برای اینکه بتوان نمونه‌ها را برای مدت طولانی نگهداری کنید باید آن‌ها را در دمای 80- یا 20- منجمد نمایید.

بهترین محیط‌ها، ساکارز/فسفات/گلوتامات یا محیط SPG (ساکارز: g/litre 74، KH2PO4: g/litre 0/512، K2HPO4: g/litre 1/237) و ال-گلوتامیک اسید (g/litre 0/721) می‌باشد که می‌توان از مکمل‌هایی چون سرم جنین گاوی 10 %، آنتی‌بیوتیک (استرپتومایسین و جنتامایسین مناسب هستند در حالی‌که پنی‌سیلین مناسب نیست) و ممانعت‌کننده‌های رشد قارچ نیز استفاده نمود (آمفوتریسین B).

نسبت بافت به محیط 1/10 می‌باشد و متناوباً 1 گرم بافت در زمینه sand سترون و در 8 میلی‌لیتر محیط انتقالی به‌کار برده می‌شود.

جنین جوجه: نمونه‌های مورد آزمایش با استفاده از سوسپانسیون 10 % در آبگوشت مغذی حاوی استرپتومایسین (نباید از پنی‌سیلین استفاده کرد) (gμ /ml 200) آماده می‌شوند؛ ml 0/2 سوسپانسیون در کیسه زرده جنین‌های 6-8 روزه تلقیح می‌شود و سپس در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گرم‌خانه گذاری می‌شوند.

جنین‌های آلوده 4 تا13  روز بعد از تلقیح تلف می‌شوند. سپس با تهیه گسترش از غشاء عروقی کیسه زرده می‌توان تعداد اجسام اولیه را مشخص نمود.

کشت سلول‌ها: کلامیدوفیلا آبورتوس را می‌توان در انواع مختلفی از سلول‌ها جداسازی نمود. اما از سلول‌های (BGM) Buffalo Green Monkey،McCoy یا سلول کلیه نوزاد همستر (BHK) بیشتر استفاده می‌شود.

برای تأیید تشخیص از تعلیق کشت سلول تک لایه‌ای در محیط رشد با غلظت 10⁵×2 سلول در هر میلی‌لیتر استفاده می‌شود. قسمتی از 2 میلی‌لیتر سوسپانسیون در بطری‌های شیشه‌ای با کف صاف که هریک دارای یک پوشش منفرد 16 میلی‌متری می‌باشند، توزیع می‌شود.

هم ریز شدن پوشش‌های تک لایه بعد از گرم‌خانه گذاری به مدت24  ساعت و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد، ایجاد می‌شود. محیط رشد با 2 میلی‌لیتر آزمون تلقیح جابه‌جا و جایگزین می‌شود، سپس برای تشخیص آلودگی با دور g 25000 به مدت 30 دقیقه در پوشش تک لایه سانتریفوژ می‌شود.

تک لایه‌های پوشش‌دار بعد از اینکه به مدت 2 تا 3 روز گرم‌خانه گذاری شدند، در متانول ثابت شده و با گیسما یا Gimenez رنگ‌آمیزی می‌شوند. در این هنگام کشت‌های آلوده حاوی اجسام بازوفیلیک (در رنگ‌آمیزی گیسما) یا ائوزینوفیلیک (در رنگ‌آمیزی Gimenez) می‌باشند.

روش‌های مشابه دیگری نیز جهت تشخیص آنتی‌ژن کلامیدوفیلا آبورتوس وجود دارد، برای مثال آزمون فلئورسنت آنتی‌بادی می‌تواند مورد استفاده قرار گیرد که به اندازه روش‌های قبلی با ارزش می‌باشد.

می‌توان با انجام درمان‌های شیمیایی سلول‌های کشت داده شده، فعالیت کلامیدیا‌ها را افزایش داد. برای رشد اختصاصی کلامیدیاها، مواد مختلفی که برای اتصال به تلقیح توضیح داده شده است، قبل یا در طی آلودگی استفاده می‌شود.

تک لایه‌های پوشش‌داری که در معرض قرار می‌گیرند شامل سیکلوهگزیمید (μg/ml 0/5) در محیط نگه‌دارنده، امتین (μg/ml 1) 5 دقیقه قبل از عفونت، 5 یدو 2 داکسی یوریدین (μg /ml 8) سه روز قبل از عفونت می‌باشند.

در مواردی که سلول‌های پیش شرط در دسترس هستند، روش جداسازی اخیر نیاز به زمان دارد تا اجرام بیشتری به‌طور موفقیت‌آمیز جداسازی شوند.