به گزارش «سرویس دام، طیور و آبزیان» «ماکی دام - پایگاه خبری صنعت دام، طیور و آبزیان»؛ طیف وسیعی از روش‌های سریع وجود دارد که جهت تشخیص لیستریا مونوسیتوژنز در نمونه‌های غذایی و نمونه‌های مربوط به دام‌های آلوده، مورد استفاده قرار می‌گیرد. استاندارد طلایی روش‌های معمول با سایر روش‌ها مقایسه می‌شود و حساسیت این روش‌ها معمولاً خیلی بالا است.
در این روش‌ها، عوامل انتخابی که در روش‌های غنی‌سازی استفاده می‌شود کاربرد دارد تا میزان آلودگی به سایر میکروارگانیسم کاهش یافته و تکثیر لیستریا مونوسیتوژنز افزایش یابد.
روش‌های تعیین تحت تیپ‌های مختلف سویه‌های لیستریا مونوسیتوژنز وجود دارد ازجمله تعیین سروتیپ‌ها، تعیین فاژ، الکتروفورز آنزیم مولتی لوکوس، الگو‌های هضم آنزیمی مقاوم به اسید نوکلئیک (الکتروفورز معمولی و با زمینه ژل ضربان‌دار)، تعیین توالی نوکلئیک اسید و تقویت تصادفی DNA چند شکلی.
روش‌های معمول باکتری‌شناسی به‌دلایل مختلفی از جمله اینکه نتایج استفاده از آن‌ها در کشت خالص ارگانیسم برای اهداف خاص مفید می‌باشد، اهمیت دارند. معمولاً این روش‌ها حساسیت بالایی داشته و نیازی به تجهیزات پیچیده و گران قیمت ندارد.
ازجمله معایب این روش‌ها این است که پروتکل آن‌ها برای کامل شدن احتیاج به زمان طولانی دارد.
در این روش‌ها دست‌کاری‌های زیادی صورت می‌گیرد، احتیاج زیاد به مواد شیمیایی مختلف، معرف‌ها و محیط‌ها دارد و همچنین احتمال آلودگی با سایر میکروارگانیسم‌ها وجود دارد که رشد بیش از اندازه آن‌ها باعث پوشیده شدن حضور میکروارگانیسم اصلی شده، امکان مشاهده واریانت‌های غیرتیپیک ارگانیسم اصلی را فراهم می‌کند و رشد این باکتری‌ها در پلیت‌های انتخابی و پلیت آگار تفریق کننده، مشکلاتی را در شناسایی ارگانیسم اصلی ایجاد می‌کند.
برای جداسازی و تشخیص لیستریا مونوسیتوژنز از غذا، نمونه‌های محیطی و نمونه‌های دامی، لازم است از مواد انتخابی و روش‌های غنی‌سازی استفاده شود، که استفاده از آن‌ها باعث می‌شود میزان آلودگی با سایر ارگانیسم‌ها در یک سطح معقولی باقی بماند، در حالی که میزان تکثیر لیستریا مونوسیتوژنز به‌حدی می‌رسد که برای تشخیص کفایت می‌کند.
غنی‌سازی سرد لیستریا مونوسیتوژنز از روز‌های ابتدایی باکتری‌شناسی بالینی لیستریا به‌طور منظم استفاده می‌شود به این منظور که ارگانیسم را قادر سازد تا در دمای یخچال تکثیر یابد، این در حالی است که سایر ارگانیسم‌ها در این شرایط تکثیر پیدا نمی‌کنند.
به هرحال این روش احتیاج به گرم‌خانه‌گذاری طولانی (اغلب چند ماه) دارد و این امر استفاده از آن را در تحقیقات فعلی، در همه‌گیری‌ها با منشأ تغذیه‌ای و موارد انفرادی و همین‌طور در اجرای بررسی‌های برنامه‌های کنترل نقاط بحرانی، غیرممکن می‌سازد.
ترکیبات انتخابی باعث رشد لیستریا مونوسیتوژنز می‌شوند و با گنجاندن آن‌ها در گرم‌خانه با دمای طبیعی و در محیط کشت، مدت زمان موردنیاز برای رشد انتخابی ارگانیسم، کوتاه می‌شود.
ازجمله این ترکیبات انتخابی می‌توان به سیکلوهگزیمید، کولیستین، سفوتتان، فسفو مایسین، لیتیوم کلراید، نالیدیکسیک اسید، آکریفلاوین، فنیل اتانول، سفتازیدیم، پلی‌میکسین B و موکسالاکتان اشاره نمود.
ازجمله روش‌های باکتری‌شناسی برای تشخیص لیستریوز کشت مستقیم از نمونه‌ها بر بلاد آگار یا سایر محیط های غنی شده و استفاده همزمان از روش غنی‌سازی سرد همراه با ساب کالچر ضعیف به مدت دوازده هفته، می‌باشد.
می‌توان آنتی‌ژن لیستریا مونوسیتوژنز را با کمک روش‌های ایمونوشیمی برروی بافت‌های ثابت شده با فرمالین، تشخیص داد. مشخص شده است این روش در تشخیص شکل التهاب مغزی لیستریوز نشخوارکنندگان، حساسیت بالاتری نسبت به پلیت مستقیم و کشت باکتریایی غنی شده سرد دارد.
به‌کارگیری روش‌های دیگر غنی‌سازی و عوامل انتخابی جهت جداسازی لیستریا مونوسیتوژنز از غذا و نمونه‌های محیطی و انجام بررسی‌های باکتری‌شناسی اهمیت دارد.
هیچ روش منفردی برای تشخیص لیستریا مونوسیتوژنز از همه انواع خوراک‌ها به اندازه کافی ازنظر حساسیت معتبر نیست.
علاوه براین، سلول‌های لیستریا مونوسیتوژنز در غذا‌های فرآوری شده در اثر انجماد، حرارت، اسیدی شدن و سایر عوامل فیزیکی یا شیمیایی، به صورت تحت کشنده آسیب می‌بینند، چنین باکتری‌هایی قبل از اینکه بتوان آن‌ها را در کشت شناسایی کرد، نیاز به شرایط کشت ویژه برای ترمیم آسیب‌ها دارند.
الف) روش‌های جداسازی
روش‌های معمول جداسازی لیستریا مونوسیتوژنز از بافت‌های دام‌ها شامل کشت مستقیم نمونه‌ها در بلاد آگار گوسفند یا سایر محیط‌های کشت غنی شده و استفاده هم زمان از روش غنی‌سازی سرد همراه با ساب کالچر ضعیف به مدت 12 هفته می‌باشد.
زمانی که تعداد زیادی ارگانیسم در یک ناحیه طبیعی سترون وجود دارد، جداسازی ارگانیسم به‌وسیله کشت مستقیم تقریباً کار آسانی است، مانند زمانی که سپتی‌سمی در دام ایجاد شده است.
اما زمانی که تعداد ارگانیسم کم است (مانند شکل التهاب مغز بیماری یا زمانی که نمونه‌ها به شدت آلوده شده‌اند) جداسازی جرم دشوار است.
در دام‌های مبتلا به لیستریوز نمونه‌ها باید بر اساس یافته‌های بالینی انتخاب شوند. نمونه‌ها از جراحات کبدی، کلیه‌ها و یا طحال تهیه می‌شوند و در مواردی که دام سپتی‌سمی دارد می‌توان از مایع نخاعی، پل مغزی و مدولا در شکل التهاب مغزی لیستریوز، جفت (کوتیلودون)، محتویات شیردان جنین و یا ترشحات رحمی در دام‌های سقط کرده استفاده نمود.
برای جابه‌جایی، ذخیره‌سازی و حمل ونقل نمونه‌ها باید آن‌ها را در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سرد نمود. نمونه‌های سرد تا زمانی که می‌خواهیم آن‌ها را بررسی و آزمایش کنیم سرد باقی بمانند.
در زیر پروتکلی جهت جداسازی لیستریا مونوسیتوژنز از نمونه‌های بدست آمده از کالبدگشایی دام‌ها توضیح داده شده است:
• روش جداسازی از نمونه‌های کالبدگشایی دام‌ها
1) 10-25 گرم یا میلی‌لیتر از نمونه (بسته به میزان نمونه موجود) را داخل 225 میلی‌لیتر براث غنی شده لیستریا تلقیح کنید. میزان تلقیح نمونه‌هایی که از دام‌های مبتلا به لیستریوز جمع‌آوری کرده‌اید، کم‌تر از نمونه‌های غذایی است (25 گرم یا میلی‌لیتر).
در مورد نمونه‌های آلوده، تا آنجایی که می‌شود باید میزان زیادی تلقیح نمود (25-10 گرم یا میلی‌لیتر). (محیط پایه براث غنی شده لیستریا: براث اکسوئید تریپتون سویا: 30 گرم، عصاره مخمر دیفکو: 6 گرم، آب: 1 لیتر، مواد انتخابی: اکریفلاوین: 2/3 میلی گرم، نالیدیکسیک اسید: 9/2 میلی‌گرم، سیکلوهگزامید: 11/5 میلی گرم، مواد انتخابی به 225 میلی‌لیتر براث پایه اضافه می‌شود).
2) براث را در دمای 30 درجه سانتی‌گراد به مدت 48 ساعت گرم‌خانه گذاری کنید.
3)0/1 میلی‌لیتر کشت براث غنی شده را بر روی پلیت آگار آکسفورد گسترش دهید.
4) پلیت را در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گرم‌خانه گذاری کنید. رشد باکتری را بعد از 24 و 48 ساعت بررسی کنید. 5 کلونی را آزمایش کنید (اگر تعداد کلونی‌ها کم بود همگی آن‌ها را آزمایش نمایید) و ظاهر تیپیک لیستریا مونوسیتوژنز را بررسی کنید: شکل سلول، واکنش گرم، فعالیت همولیتیک در بلاد آگار (خون فیبرینه شده اسب)، تحرک در دمای 20 درجه سانتی‌گراد، تخمیر گلوکز (+)، رامنوز (+)، زایلوز (-)، هیدرولیز اسکولین و تولید کاتالاز.
محیط کشتی که آماده کرده‌اید باید ازلحاظ کیفیت کنترل شود و این محیط کشت باید موجبات رشد ارگانیسم‌های مشکوک از تلقیح کم نمونه را فراهم سازد. سویه مرجع را باید به‌صورت موازی از نمونه‌های مشکوک کشت داد تا از اینکه آزمایش به‌درستی کار می‌کند مطمئن شد.
نمونه‌های خوراک که جهت بررسی تهیه می‌شوند باید نماینده کل خوراک (شامل سطخ خارجی و داخلی آن) باشند. روش‌های کشت معمول شامل یک روش غنی‌سازی بر پایه استفاده از محیط کشت مایع محتوی مواد انتخابی است.
ماهیت محیط و مواد انتخابی در روش‌های مختلف متفاوت است. نمونه‌ها به مدت 72-24 ساعت و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد غنی‌سازی می‌شوند. بعد از غنی‌سازی انتخابی، کشت‌ها داخل پلیت و بر روی پلیت آگار انتخابی/تفریقی برای جداسازی کلونی‌های احتمالی لیستریا مونوسیتوژنز قرار داده می‌شوند.
تقریباً در همه روش‌ها از آگار آکسفورد یا آکسفورد اصلاح شده استفاده می‌شود. آگار آکسفورد حاوی لیتیم کلراید، سیکلوهگزامید، کولیستین، اکریفلاوین، سفوتتان و فسفومایسین به عنوان مواد انتخابی هستند. کولونی‌های لیستریا کوچک و سیاه هستند و دور آن‌ها‌هاله سیاه قرار دارد.
ب) روش‌های تشخیصی معمول
تشخیص کلونی‌های تیپیک گونه‌های لیستریا در پلیت انتخاب/تفریقی که در بالا توضیح داده شد، با استفاده از آزمون‌های battery صورت می‌گیرد. این آزمون‌ها شامل واکنش رنگ‌آمیزی گرم، کاتالاز، حرکت (به‌صورت مرطوب که زیر میکروسکوپ فاز کانتراست مشاهده می‌شوند و همچنین با استفاده از تلقیح در محیط تست حرکت)، همولیز و مصرف کربوهیدرات می‌باشند.
آزمونChristie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP) ابزاری بسیار کارآمد جهت کمک به تشخیص گونه‌های لیستریا است.
این روش راحت بوده و قرائت نتایج آن آسان می‌باشد. این آزمون شامل یک لایه از همولیز بتای استافیلوکوکوس ارئوس (ATCC سویه 49444 یا 25923، NCTC سویه 7428 یا 1803) رودوکوکوس اکوئی (ATCC سویه 6939 و NCTC سویه 1621) می‌باشد که در لایه‌های مستقیم انفرادی به‌صورت موازی یا روی بلاد آگار گوسفند یا پلیت آگار دو لایه همراه با یک لایه خیلی نازک از بلاد آگار، پوشانده شده است.
بعد از گرم‌خانه گذاری به مدت 48-24 ساعت و در دمای -37 درجه سانتی‌گراد (در صورت استفاده از پوشش نازک بلاد آگار 18-12 ساعت)، یک واکنش مثبت شامل یک ناحیه تقویت شده با همولیز بتا، در نقطه مشترک تست/کنترل و سویه مرجع لیستریا مونوسیتوژنز مشاهده می‌شود.
لیستریا مونوسیتوژنز با لایه استافیلوکوکوس ارئوس مثبت و با رودوکوکوس اکوئی منفی می‌شود.