به گزارش «سرویس آموزشی» «ماکی دام - پایگاه خبری صنعت دام، طیور و آبزیان»؛ یکی از روش‌های نوین شناخت و تشخیص بیولوژیک، واکنش زنجیره‌ای پلیمریزاسیون (PCR) می‌باشد. در یک جمله:«PCR روش شناسایی ماده بیولوژیک مورد آزمون بر پایه یکی از ژن‌های اختصاصی آن ماده است.»
هدف از واکنش PCR، تولید کپی‌های فراوان از این ژن مشخص می‌باشد لذا برای انجام این واکنش، داشتن الگوی آغازگر Template به مقدار کافی ضروری است. وقایع PCR را می‌توان در دو بخش اصلی تشریح کرد:
الف) واکنش‌های چرخه‌ای The Cycling Reactions
در هر واکنش PCR، سه مرحله اصلی زیر، ۳۰ تا ۴۰ بار تکرار می‌شوند. همه این واکنش‌ها در این دستگاه Thermal Cycler ترمال سایکلر به‌طور خودکار انجام می‌گیرند و این دستگاه می‌تواند لوله‌های آزمایش مخصوص حاوی مواد آزمایش را با سرعت بسیار زیاد به یک باره گرم یا سرد نماید.
١- تخریب Denaturation در دمای ۹۴ درجه سانتی‌گراد. در طی مرحله تخریب، زنجیره‌های دو رشته‌ای DNA به دو رشته تکی باز می‌شوند. در این مرحله تمام واکنش‌های آنزیمی مثل چرخه قبلی متوقف می‌شوند.
۲- باز پخت شدن Annealing در دمای ۵۴ درجه سانتی‌گراد. در این مرحله پرایمرها (مواد آغازکننده) با حرکت زیگزاگی (براونی=Brownian) خود درتمام لوله آزمایش می‌جهند و می‌غلتند. پیوندهای یونی مرتبا بین پرایمرهای تک رشته شكل گرفته و شکسته می‌شوند.
پیوندهای كمی مستحکم‌تر، کمی بیشتر دوام می‌آورند. این پیوندها شامل پرایمرها است که کاملا به الگو چسبیده‌اند. در این قطعه کوچک DNA ۲ رشته‌ای (الگو وپرایمر)، آنزیم پلیمراز می‌تواند بچسبد و کپی کردن از روی الگورا آغاز کند.
به محض اینکه تعدادی از بازهای آلی در جای خود قرار می‌گیرند، پیوند یونی بسیار محکم بین پرایمر و الگو شکل می‌گیرد که هرگز بازشکسته نمی‌شود.
٣- امتداد یافتن Extension در دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد دمای ۷۲ درجه بهترین دما برای قرار گرفتن آنزیم پلیمراز است. در محلی که تعدادی از بازهای آلی ساخته شده‌اند، پرایمرها پیوندهای یونی محکمی را با الگوایجاد می‌کنند به نحوی‌که این پیوندها، ازهر نیرویی که توان شکستن‌شان را دارد بسیار قوی‌تر‌اند، ولی پرایمرهایی که در موقعیت‌های نادرست قرار گرفته‌اند (به علت دمای بالاتر) دوباره شکسته می‌شوند و نمی‌توانند امتداد یافتن قطعه را دنبال کنند.
بازهای آلی (که مکمل الگو هستند) از طرف ۳ به پرایمر می‌چسبند (پلیمراز dNTPها را از طرف ۵ به ۳ اضافه می‌کند در حالی که الگو را از طرف ۳ به ۵ می‌خواند). از آنجایی که هر دو رشته طی کار دستگاه PCR کپی می‌شوند، یک افزایش تصاعدی در تعداد کپی‌های یک ژن به وجود می‌آید.
به فرض آنکه قبل از آغاز کار، تنها یک کپی از ژن خواسته شده وجود داشته باشد، بعد از چرخه یک، ۲ کپی و بعد از چرخه دو،۴ کپی و به همین ترتیب بعد از چرخه سه، ۸ کپی ایجاد می‌شود و این روند ادامه خواهد داشت.
شکل ۱- مراحل مختلف PCR
در یک جمله PCR روش شناسایی ماده بیولوژیک مورد آزمون بر پایه یکی از ژن‌های اختصاصی آن ماده است.
تشكل ۲ - کپی تصاعدی یک ژن در PCR
ب) آیا ژنی که در طی PCR کپی شد، وجود دارد و آیا در اندازه طبیعی خود است؟
قبل از اینکه محصول PCR مورد استفاده بعدی قرار بگیرد لازم است برای موارد زیر چک شود:
۱- آیا محصول تشکیل شده است؟
گرچه دانش بیوشیمی یک دانش دقیق است، ولی همیشه PCR موفقیت‌آمیز نیست. مثلا یک احتمال وجود دارد که کیفیت DNA پایین باشد چرا که یا یکی از پرایمرها درست جایگزین نشده است و با الگو‌ها آغازگر متعددی وجود داشته‌اند.
۲- آیا محصول در اندازه درست خود است؟
احتمال دارد که محصول مثلا دارای ۵۰۰ باز آلی باشد در حالی که ژن خواسته شده ۱۸۰۰ باز درازا داشته باشد، در این مورد احتمالا یکی از پرایمرها، بر قسمتی از ژن جایگزین شده است که نزدیک‌تر از پرایمر دیگر است. همچنین احتمال دارد هردو پرایمر در دوژن کاملا متفاوت جایگزین شده باشند.
٣- فقط یک رشته تشکیل شده باشد.
بنابر توضیحات بالا، امکان دارد پرایمرها در محل موردنظر جایگزین شده و یا در محل دیگری جایگزین شوند. در این مورد باندهای متعددی در یک ستون ژل تشکیل می‌شوند.
شکل 3- تأیید درستی محصول PCR روی ژل
در تصویر نردبان مخلوطی از قطعات ژنی شناخته شده برای مقایسه با قطعات حاصل PCR است. دقت شود که فاصله بین قطعات مختلف نردبان لگاریتمی‌است.
ستون ۱: محصول PCR تقریبأ به اندازه ۱۸۵۰ باز آلى درازا دارد.
ستون ۲ و ۴: محصول PCR تقریبا به اندازه ۸۰۰ باز آلى درازا دارد.
ستون ۳: هیچ محصولی شکل نگرفته است پس PCR موفق نبوده است.
ستون ۵: باندهای مختلفی شکل گرفته چراکه یکی از پرایمرها در جاهای مختلف جایگزین شده است.