جمع آوری نمونه جهت جداسازی مایکوپلاسما یا یوریاپلاسما

به گزارش «سرویس دام، طیور و آبزیان» «ماکی دام - پایگاه خبری حیوانات خانگی، دام، طیور و آبزیان»؛ برای جداسازی ارگانیسم‌های مایکوپلاسما یا یوریاپلاسما، سوآب‌های داکرون یا پلی استر برای جمع‌آوری نمونه از فرج و واژن نیاز است. سوآب باید بلافاصله در محیط انتقال بدون چارکول غوطه‌ور شده و منجمد شود.

نمونه‌ها باید تا زمان ورود به آزمایشگاه منجمد باشند. نمونه‌های ارجح برای جداسازی یوریاپلاسما دای ورزوم یا گونه مایکوپلاسما شامل ریه، کارنکول، محتویات معده و مایعات آمنیوتیک است.

این نمونه‌ها باید بلافاصله سرد شده و در همان روز به آزمایشگاه منتقل شود یا منجمد شده و به شکل منجمد انتقال داده شوند.

نمونه‌های لازم جهت تشخیص بیماری آگالاکسی

نمونه‌هایی که می‌توان جمع‌آوری کرد شامل سوآب بینی و نمونه شیر از دام‌های مبتلا به ورم پستان و یا دام‌های به ظاهر سالم (در مواردی که میزان تلفات و واگیری در بره‌ها بالا است)، نمونه مایع مفصلی در دام‌های مبتلا به التهاب مفاصل (آرتریت)، سوآب ملتحمه چشم در دام‌هایی که چشمشان درگیر شده است و نمونه خون برای تشخیص آنتی‌بادی در دام‌های سالم و آلوده می‌باشد.

در دام‌های تلف شده نمونه‌ها شامل پستان به همراه گره‌های لمفاوی این ناحیه، مایع مفصلی، بافت ریه (در حد فاصل بین ناحیه آلوده و سالم) و مایعات جنب و پریکارد. نمونه‌ها باید در شرایط مرطوب و سرد به آزمایشگاه ارسال گردد.

هر چهار عامل مایکوپلاسما، تقریباً به آسانی از اندام‌های داخلی، مفاصل و شیردان جدا می‌شوند و در اکثر محیط‌های کشت مایکوپلاسما، کولونی‌هایی با اندازه‌های متوسط تا بزرگ، طی 4-3 روز تشکیل می‌شود. 

نمونه‌های باکتری‌شناسی:

نمونه‌های باکتری‌شناسی شامل شیر، سوآب چشم، مایعات مفصلی (کشت هوازی و PCR) می باشد.

نمونه‌های سرم‌شناسی (آزمون تثبیت عامل مکمل و الایزا)

طبق دستورالعمل سازمان دامپزشکی کشور در سال 1391، نمونه‌های مرضی باید بصورت سترون از دام‌های بیمار جمع‌آوری شوند و به محیط ترانسپورت شامل: محیط Heart infusion broth + 20% سرم + 10% عصاره مخمر+  IU/ml200 آمپی سیلین + گلوکز 0/1 درصد + فنل رد 0/2 درصد منتقل و بلافاصله در شرایط زنجیره سرد جهت جداسازی سویه و شناسائی به آزمایشگاه ارسال شود.

جمع‌آوری نمونه

محیط مایکوپلاسما

روش مرسومی که برای جداسازی مایکوپلاسما استفاده می‌شود، قابل تعمیم برای هر چهار مایکوپلاسما می‌باشد. مایکوپلاسما‌ها، قادر به رشد در بسیاری از محیط‌ها می‌باشند. رشد پیش رونده مایکوپلاسما آگالاکتیه در محیطی که حاوی اسید‌های ارگانیک، مانند پیرووات و ایزوپروپانول است، مشاهده شده است.

فرمولاسیون محیط PRM، به شرح زیر می‌باشد:

ml/litre 100 سرم خوکی غیرفعال، g/litre 20 پپتون مخصوص، g/litre 5 عصاره مخمر، g/litre 5 گلیسرول، g/litre 5 سدیم کلرید، g/litre 9 HEPES، ml/litre 100 عصاره مخمر تازه، g/litre 5 سدیم پیرووات، ml 12/5 فنول رد 2% و آمپی‌سیلین (IU/ml 200000)، را حرارت دهید.

با استفاده از آب مقطر، حجم آن را به 1 لیتر رسانده و با فیلتر کردن آن را سترون کنید. pH محیط براث را بر روی 7/6 تنظیم کنید. محیط نیمه جامد را با افزودن 10 گرم labM agar No.1 (Bury UK، یا آگاری که همین کیفیت را داشته باشد)، آماده کنید و آن را در یک پتری دیش سترون بریزید.

تایلوزین استات mg/litre) 250) که دارای اثرات سمی بوده و از رشد برخی از مایکوپلاسما‌ها جلوگیری می‌کند، از رشد عامل آگالاکسی واگیر، ممانعت نمی‌کند و در محیط انتقالی می‌تواند یک ترکیب ضروری برای کاهش آلودگی باکتریایی نمونه‌های بالینی، محسوب شود.

اما زمانی که مایکوپلاسما‌ها در شرایط invitro رشد می‌کنند، نباید از آن استفاده شود. می‌توان به جای تالیوم استات، از کولیستین سولفات (mg/litre 37/5) استفاده نمود.

روش انجام آزمایش:

i) رقت‌های 10 برابر (10⁶ – 10¹)، از نمونه‌های مایع (شیر، مایع مفصلی، سوآب ملتحمه و گوش) یا بافت‌های همگن شده در محیط براث مناسب، تهیه کنید.

ii) چند قطره از هر نمونه را در محیط آگار پخش نمایید. سپس 10% از تلقیح را به محیط براث، اضافه کنید.

iii) سوآب‌ها را به طور مستقیم به محیط آگار منتقل کنید.

iv) براث‌های تلقیح شده و محیط آگار را در دمای 37 درجه سانتی‌گراد، با اتمسفر مرطوب و 5% کربن دی‌اکسید، گرم‌خانه گذاری کنید (در حین کار، حرکت دادن ظروف باید آرام باشد).

v) براث‌ها را هر روز ازلحاظ نشانی‌های رشد، بررسی نمایید (که به‌صورت یک منظره ابر مانند یا شیری رنگ مشخص می‌شود).

vi) اگر پس از گذشت 7 روز، هیچ نشانی از رشد مایکوپلاسما‌ها مشاهده نشود، لازم است ساب کالچر 10% از تلقیح براث در براث جدید تهیه گردد و حدود 50 میکرولیتر از آن در محیط آگار، پخش شود.

vii) مرحله (v) را مجدداً تکرار کنید. اگر پس از گذشت 21 روز از گرم‌خانه گذاری، هیچ مایکوپلاسمایی رشد نکرد، می‌توان نتیجه را منفی درنظر گرفت.

viii) اگر آلودگی باکتریایی ایجاد شد (که به شکل کدورت زیاد مشاهده می‌شود)، بایستی 1 میلی‌لیتر از براث آلوده را از فیلتر 0.45 میکرونی عبور و به محیط براث جدید منتقل نمود.

معمولاً نمونه‌های بالینی، به بیش از یک گونه مایکوپلاسما آلوده هستند. بنابراین، در اغلب موارد خالص‌سازی کلون‌ها قبل از آزمایش‌های بیوشیمیایی و سرم‌شناسی (مخصوصاً در مورد آزمون‌های ممانعت از رشد GIT و ممانعت از فیلم FIT)، امری ضروری می‌باشد.

در هر صورت کلون کردن، روش زمان بری است و به حداقل دو هفته زمان احتیاج دارد. آزمون‌های ایمونوفلئورسانس، immune binding نقطه‌ای و جدیداً آزمون‌های PCR، نیازی به کلون کردن ندارند، چراکه این روش‌ها قادر به تشخیص مایکوپلاسما‌های پاتوژن در کشت‌های مخلوط هستند، ضمن اینکه زمان کمی صرف انجام آن‌ها می‌شود.

آزمایش‌های بیوشیمیایی

اولین آزمایشی که باید بر روی کلون جدا شده صورت پذیرد، آزمون حساسیت به دیجیتونین می‌باشد. این روش مایکوپلاسما‌ها را از آکولپلاسما‌ها (acholeplasma)، جدا می‌نماید.

آکولپلاسماها، آلوده‌کننده‌های همه جایی هستند که باعث رشد بیش از اندازه مایکوپلاسما‌ها می‌گردند. روش‌هایی چون رشد در محیط مایع حاوی گلوکز (1%)، آرژینین (0/2 %) و فنول فتالئین دی فسفات (0/01 %)، روش رشد بر روی محیط نیمه جامد حاوی سرم اسب یا زرده تخم‌مرغ برای شناسایی فیلم یا لکه‌ها (spots) و همینطور رشد بر روی آگار کازئین یا آگار سرم منعقد شده برای آزمون‌های پروتئولیز، تقریباً مناسب‌ترین آزمون‌هایی هستند که می‌توان برای تفریق مایکوپلاسماها استفاده نمود.

با این وجود، هریک از مایکوپلاسماها دارای ویژگی‌های بیوشیمیایی متنوعی هستند، بنابراین آزمون‌های بیوشیمیایی ارزش تشخیصی ندارند. مهم ترین ویژگی بیوشیمیایی که M.putrefacient را از سایر مایکوپلاسما‌ها تفریق می‌کند، بوی تعفن است که در کشت براث تولید می‌شود.

سایر ویژگی‌ها که می‌تواند در شناسایی مایکوپلاسما‌ها مفید باشد، شامل: تولید فیلم و لکه (spots) در سطح براث و محیط نیمه جامد که توسط مایکوپلاسما آگالاکتیه و در موارد اندکی M.putrefacient، تولید می‌شود و فعالیت پروتئولیتیک Mcc و MmmLC در سرم منعقد شده و کازئین می‌باشد.

همچنین یک آزمون بیوشیمیایی سریع و بسیار مناسب که استراز C8 را فعال می‌کند، وجود دارد. یک ساعت پس از افزودن سوبسترای کروموژنیک SLPA اکتانوات، کلونی‌های قرمز رنگ مایکوپلاسما، بر روی محیط آگار، ظاهر می‌شوند (یک استر سنتتیک جدید، ساخته شده از یک اسید چرب C8 و یک کروموزوم فنولیک).

این فعالیت به‌صورت مشترک با مایکوپلاسما بوویس صورت می‌گیرد البته این گونه مایکوپلاسما به‌ندرت در نشخوارکنندگان کوچک یافت می‌شود. جداسازی مایکوپلاسما آگالاکتیه، احتیاج به کلون کردن ندارد، چراکه این باکتری، به راحتی در کشت‌های مخلوط قابل شناسایی است. در صورت لزوم، می‌توان از روش‌های PCR جهت تفریق M.agalactiae و M.bovisاستفاده نمود.