به گزارش «سرویس دام، طیور و آبزیان» «ماکی دام - پایگاه خبری صنعت دام، طیور، آبزیان و حیوانات خانگی»؛ نمونه‌های به‌دست آمده برای جداسازی باید بدون اینکه منجمد شوند در کنار یخ منتقل گردند.
نمونه‌ها جهت آزمایش‌های انگل‌شناسی: مغز، ریه، جفت به‌صورت تازه یا منجمد
نمونه‌ها جهت آزمایش‌های سرم‌شناسی: مایع قفسه سینه جنین (هماگلوتیاسیون غیرمستقیم)
نمونه‌ها جهت بررسی‌های بافت‌شناسی: کوتیلودون‌های جفت، ریه، کبد، مغز، نخاع، کلیه و قلب (جهت مشاهده با میکروسکوپ نوری و ایمونوهیستوشیمی)
تشخیص توکسوپلاسموز با استفاده از نمونه‌های زیر امکان‌پذیر است:
- جفت
- مغز جنین‌های سقط شده
- مایعات جنینی
- خون: نمونه خون از میشی که سقط کرده است و نمونه خون بره زنده قبل از مصرف آغوز
- مایع مغزی نخاعی
- سوآب بینی
جداسازی توکسوپلاسما گوندیی از کوتیلودون‌های جفت (5-2 گرم کوتیلودون)، مغز، مایعات جنب و صفاق و خون قلب جنین سقط شده‌ای که خیلی دستخوش هضم خودبه خودی (اتولیز) نشده است، می‌تواند صورت گیرد.
بهترین نمونه، مغز جنین سقط شده می‌باشد و نمونه‌ها باید تا حد ممکن بلافاصله بعد از سقط تهیه شوند. اگر نتوان آزمایشات لازم را بلافاصله بعد از جمع‌آوری روی نمونه‌ها انجام داد، باید نمونه‌ها را در دمای 20 - درجه سانتی‌گراد منجمد کرد.
نمونه‌گیری از جفت
5 یا 6 کوتیلودون به همرا غشای بین کوتیلودونی باید در ظروف سترون جمع‌آوری شود. نمونه‌گیری از جفت باید قبل از اینکه کثیف شود صورت گیرد. اگر کوتیلودون‌ها کثیف شوند می‌توان آنها را با سرم فیزیولوژی شست.
نمونه‌های بافت شناسی
5 یا 6 عدد کوتیلودون و کل مغز جنین سقط شده که خیلی دچار هضم خود به خودی (اتولیز) نشده باشد، باید به‌شکل سترون (آسپتیک) تهیه گردد و در ظروف شیشه‌ای حاوی ثابت‌کننده مناسب قرار گیرد.
تشخیص پادتن
هنگامی‌که نمونه خون در زمان سقط جمع‌آوری می‌شود، عیار پادتن علیه تکسوپلاسما گوندیی بالا است. نمونه خون بره‌های زنده و ضعیف، قبل از مصرف آغوز می‌تواند جهت تشخیص عیار پادتن مورد استفاده قرار گیرد.
نمونه‌های خونی که جهت آزمایشات سرم‌شناسی تهیه می‌شوند باید ترجیحاً به‌صورت سترون (استریل) جمع‌آوری شده و به لوله‌های شیشه‌ای منتقل شوند و در اسرع وقت به آزمایشگاه ارسال گردند.
تشخیص جرم
جداسازی: جنین سقط شده گوسفند و بز و پرده‌های جنینی، بهترین نمونه‌ها جهت جداسازی توکسوپلاسما گوندیی با تلقیح به موش آزمایشگاهی می‌باشند. همچنین بهترین بافت‌ها شامل مغز جنین و کوتیلودون‌های جفت است.
نتایج مثبت از نمونه‌های تازه و بدون آلودگی بدست می‌آید، نمونه‌ها را نباید منجمد کرد، چراکه این کار انگل را ازبین می‌برد.
i) با رعایت اصول سترونی، 5-2 گرم کوتیلودون‌های جفت یا بافت مغز را از جنین سقط شده جمع‌آوری کنید.
ii) بافت را با 0/3 مولار بافر فسفات سالین سترون (FBS)، در 7/4: pH و همراه با آنتی‌بیوتیک (به میزان IU/ml 100 پنی سیلین و IU/ml 745 استرپتومایسین)، در یک stomacher یا هر وسیله‌ای که باعث نرم شدن بافت می‌شود، همگن کنید.
می‌توان برای همگن کردن بافت مغز، آن را 10 مرتبه از سوزن با گیج 16 و بوسیله سرنگ عبور داد.
iii) به هریک از موش‌هایی که فاقد آلودگی با توکسوپلاسما هستند، ازطریق داخل صفاقی 0/5 میلی‌لیتر از مخلوط همگن فوق تلقیح کنید.
iv) از 6 تا 8 هفته بعد موش‌ها را بکشید و مغز آنها را خارج کنید. خون موش‌ها نیز در این مرحله باید اخذ شود، سرم آن جدا شده و در دمای 20- ذخیره گردد. مغز موش‌هایی که قبل از 8-6 هفته می‌میرند نیز، باید برداشت شود.
v) مغز هریک از موش‌ها را با حجم مساوی از PBS سترون، از یک سوزن با گیج 16، ده مرتبه عبور دهید تا همگن شود.
vi) یک قطره (5 میکرولیتر) از تعلیق حاصل را در هر 5 لام پخش کنید.
vii) سپس آن را خشک و با گیمسا رنگ آمیزی کنید، سپس آن را زیر یک cover slip قرار دهید.
viii) لام‌ها را زیر میکروسکوپ بررسی کنید. کیست‌های بافتی با ساختار‌هایی گرد و با اندازه 50-5 میکرومتر، مشاهده می‌شود. برادی زوایت‌های هلالی شکل، به رنگ آبی مشاهده می‌شود.
یک روش دیگر برای بررسی مغز موش، این است که قسمتی کوچک از مغز قدامی را جدا نمود و آن را با یک cover slip کاملاً له کرد. کیست‌های بافتی به‌راحتی در زیر میکروسکوپ قابل شناسایی هستند.
اگر بافت‌های تلقیح شده آلودگی بالایی با توکسوپلاسما گوندیی داشته باشند، ممکن است موش‌ها بعد از 2-1 هفته تلف شوند.
عدم موفقیت در شناسایی کیست‌های بافت، نشان‌دهنده عدم آلودگی نمی‌باشد. می‌توان سرم موش‌ها را ازلحاظ حضور آنتی‌بادی‌های ضدتوکسوپلاسما بررسی نمود (برای مثال استفاده از آزمون فلئورسنت آنتی‌بادی غیرمستقیم). اگر نتیجه این آزمایش‌ها نیز منفی شد، احتمال آلودگی با توکسوپلاسما وجود ندارد.
آزمون‌های سرم‌شناسی
برای شناسایی پادتن‌های ضدتوکسوپلاسما گوندیی، آزمون‌های سرم‌شناسی مختلفی وجود دارد. برای نمونه، اساس برخی از این آزمون‌ها، رنگ تاکی زوایت‌ها در زیر میکروسکوپ می‌باشند، مانند (DT) Dye Test و (IFA).
برخی دیگر از آزمون‌ها براساس آگلوتیناسیون تاکی زوایت‌های توکسوپلاسما، گلبول‌های قرمز یا ذرات لاتکس هستند (مانند آگلوتیناسیون مستقیم (DAT) ، آزمون هم آگلوتیناسیون غیرمستقیم (IHA) و آگلوتیناسیون لاتکس.(CA))
با آزمون الایزا، درجات تغییر رنگ، مشخص‌کننده میزان آنتی‌بادی‌های اختصاصی در یک محلول است.
DT، استاندارد طلایی آزمون‌های سرم‌شناسی برای تشخیص آنتی‌بادی‌های توکسوپلاسما در انسان است.
تاکی زوایت‌های زنده توکسوپلاسما، همراه با عوامل فرعی شبه کمپلمان و سرم آزمایش، قبل از افزودن متیلن بلو، در دمای 37 درجه سانتی‌گراد برای 1 ساعت، گرم‌خانه گذاری می‌شود.
آنتی‌بادی اختصاصی نفوذپذیری غشاء انگل را تحریک می‌کند، به‌طوری که سیتوپلاسم به بیرون نشت می‌کند. تاکی زوآیت‌ها رنگ نمی‌گیرند، چراکه به آنتی‌بادی عرضه نمی‌شوند تا به رنگ آبی تظاهر یابند (مانند نمونه سرم منفی).
DT دارای حساسیت و ویژگی بالایی در انسان است، اما ممکن است برای سایر گونه‌ها غیرقابل اطمینان باشد. علاوه براین DT می‌تواند به‌دلیل استفاده از انگل زنده، خطرآفرین باشد. این آزمون گران است و نیاز به مهارت و تخصص بالایی دارد.
تاکی زوآیت‌ها باید در کشت سلول و نه در صفاق موش، رشد کنند.
IFA یک روش ساده است که به‌طور گسترده‌ای مورد استفاده قرار می‌گیرد. تمامی تاکی زوآیت‌های کشته‌شده با سرم تست رقیق رشده، گرم‌خانه گذاری می‌شوند. سرم ضد گونه فلئورسانس اضافه شده و نتیجه با کمک میکروسکوپ فلئورسانس مشاهده می‌شود.
آنتی‌بادی‌های نشاندار فلئورسنت، برای گونه‌های مختلف حیوانی، به‌صورت تجاری موجود می‌باشند این روش تقریباً ارزان بوده و کیت‌های آن به‌صورت تجاری موجود می‌باشد.
با این وجود، از آنجا که این روش احتیاج به میکروسکوپ فلئورسانس دارد و نتایج با چشم خوانده می‌شود، ممکن است تفاوت‌های فردی در قرائت نتایج به‌وجود آید. امکان دارد پیدا کردن برخی از کونژوگه‌های مختص گونه، دشوار باشد.
علاوه بر این، خطر واکنش متقاطع با فاکتور روماتوئید و آنتی‌بادی‌های ضد هسته ای، وجود دارد.
DAT، دارای حساسیت و ویژگی بالایی است. تاکی زوآیت‌های فرمالینه شده توکسوپلاسما، به چاهک U شکل پلیت میکروتیتر، اضافه و رقت سرم‌های تست، آماده می‌شود، نمونه‌های مثبت، ایجاد آگلوتیناسیون می‌کنند که می‌تواند درجات مختلفی داشته باشند.
در حالی‌که نمونه‌های منفی، باعث ایجاد یک تکمه (در اثر رسوب تاکی زوآیت‌ها) در کف چاهک می‌شوند. این آزمون ساده بوده و کیت‌های آن به‌صورت تجاری موجود است، اما میزان زیادی آنتی‌ژن احتیاج دارد.
DAT و LAT، اختصاصی گونه نیست و قابلیت استفاده در همه گونه‌ها را دارد.
در الایزای اصلی، از یک آنتی‌ژن محلول که از تاکی زوآیت‌های سویه RH توکسوپلاسما به‌دست می‌آید، استفاده می‌شود و این آنتی‌ژن‌ها در چاهک‌های پلیت میکروتیتر، ریخته می‌شوند.
سرم‌های تست و سپس آنزیم‌های ضد گونه نشاندار کونژوگه (مانند پراکسیداز نشاندار horse radish ضد IgG گوسفندی)، اضافه می‌شوند.
هرکدام از کونژوگه‌های متصل شده، باعث ایجاد تغییر رنگ در سوبسترایی که به‌طور مستقیم وابسته به میزان آنتی‌بادی باند شده دارد، می‌شوند. این آزمون ساده است و می‌توان با آن به آسانی تعداد زیادی نمونه را مورد آزمایش قرار داد همچنین می‌توان به سادگی با کونژوگه ضد گونه انتخابی، این آزمون را انجام داد.
کونژوگه‌های ضد گونه مشخص، سوبسترا‌ها و کیت‌های کامل، به‌صورت تجاری موجود می‌باشند. به هر حال این آزمون، احتیاج به اسپکتروفوتومتر دارد. در آزمایشگاه‌هایی که باید تعداد زیادی نمونه را بررسی کنند، آزمون الایزا، روش بسیار مناسبی است.
اخیراً از روشی به نام الایزای (KELA) kinetics، استفاده می‌شود. سیستم KELA ، میزان پاسخ بین آنزیم باند شده و محلول سوبسترا که باعث تولید رنگ می‌شود را اندازه‌گیری می‌کند.
سه تراکم چشمی، در فواصل 45 ثانیه‌ای، با استفاده از برنامه مدیریت داده‌های KELA، خوانده شده و نتایج به دست آمده ازلحاظ دامنه، گزارش می‌شود.
ارتباط زیادی بین الایزا و KELA وجود دارد، بنابراین، این دو آزمون ابزار‌های تشخیصی بسیار مناسبی هستند و تفاوت آنها فقط در تسهیلات نرم افزاری می‌باشد.
برای افزایش ویژگی الایزای معمولی، آزمونی وجود دارد که در آن از آنتی‌ژن‌های نوترکیب و آنتی‌ژن‌های اختصاصی توکسوپلاسمای خالص با میل ترکیبی، در مورد گوسفند‌ها، استفاده می‌شود. اما استفاده از این آزمون‌ها رایج نمی‌باشد.
با الایزای معمولی می‌توان ایمونوگلوبولین‌های M و G مخصوص توکسوپلاسما را تشخیص داد، که در این صورت می‌توان تا حدی توکسوپلاسموز حاد و مزمن را از یکدیگر تفریق نمود.
اخیراً استفاده از آزمون‌های تمایل سنجی، گسترش پیدا کرده است. هنگامی‌که پاسخ ایمنی به بلوغ خود می‌رسد، بعد از پایدار شدن عفونت، آنتی‌بادی‌هایی که تمایل آنها برای آنتی‌ژن افزایش یافته است (functional affinity)، گسترش می‌یابند.
می‌توان این تمایل را اندازه‌گیری کرد و جهت تشخیص عفونت فعال یا آلودگی اخیر با توکسوپلاسما گوندیی، استفاده نمود. آزمونی جهت تشخیص تمایل IgG برای آنتی‌ژن P30 توکسوپلاسما گوندیی در گوسفند، وجود دارد.
این آزمون، ابزار تشخیصی مناسبی برای تفریق عفونت‌های جدید و پایدار می‌باشد.