به گزارش «سرویس دام، طیور و آبزیان» «ماکی دام - پایگاه خبری صنعت دام، طیور و آبزیان»؛ جهت تعیین میزان شیوع لپتوسپیروز در یک دامپروری لازم است از 15 تا 20 درصد دام‌ها (از سنین مختلف) نمونه‌های خون اخذ و به آزمایشگاه لپتوسپیروز ارسال گردد.
در صورت شک به بیماری در دام یا انسان و به منظور ارسال نمونه به آزمایشگاه اکیدا توصیه می‌شود قبل از هر اقدامی با آزمایشگاه تماس گرفته و هماهنگی لازم بعمل آید تا نمونه در شرایط استاندارد تحویل آزمایشگاه گردد.
نمونه‌های مورد نیاز جهت ارسال به آزمایشگاه
1) سرم خون: در اغلب موارد تنها نمونه مورد نیاز جهت تشخیص بیماری، سرم خون بیمار می‌باشد. برای تهیه این نمونه کافی است حدود 4 میلی‌لیتر خون کامل در لوله‌های ساده و بدون ماده ضدانعقاد اخذ و پس از حدود یک ساعت نگهداری در دمای اتاق، سرم آن مستقیماً به یک لوله اپندروف منتقل گردد. ظرف اپندروف که حاوی حدود یک میلی‌لیتر سرم خون می‌باشد را در مجاورت یخ قرار داده (فلاکس حاوی یخ خشک) و همراه با برچسب و نامه‌ای که حاوی مشخصات کامل بیمار و مبدا ارسال‌کننده باشد به آزمایشگاه ارسال گردد. بهتر است همراه هر نمونه ارسالی فرم مخصوص ارسال نمونه تکمیل و به آزمایشگاه ارسال گردد.
2) ادرار (برای جداسازی باکتری): در شرایط بهداشتی و تمیز مقدار 10 تا 25 میلی‌لیتر از وسط جریان ادرار (Mid-stream urine sample) در ظروف استریل درپیچ‌دار تهیه می‌شود، ادرار جمع‌آوری شده به دو قسمت تقسیم و یک قسمت آن به ظرف استریل دیگری منتقل شده و به آن 0.5% تا 1% فرمالین خالص فیلتر شده افزوده می‌شود (100 میکرولیتر فرمالین + 10 میلی‌لیتر ادرار). هر دو ظرف نمونه ادرار با هماهنگی قبلی به آزمایشگاه ارسال می‌شود . نمونه‌های ادرار (به منظور آزمایش مستقیم و یا کشت) در ظروفی محکم محتوی یخ و دور از تابش نور همراه با نامه‌ای که مشخصات صاحب نمونه و آدرس و تلفن وی بر روی آن نوشته می‌شود در کوتاه‌ترین زمان ممکن (کمتر از یک ساعت) به آزمایشگاه ارسال گردد.
توجه: نمونه ادرار حتماً قبل از شروع درمان با آنتی‌بیوتیک، باید اخذ شود تا امکان جداسازی و یا مشاهده باکتری لپتوسپیرا میسر شود.
نکته مهم: با توجه به دوام کوتاه مدت باکتری در نمونه ادرار، قبل از اخذ نمونه حتماً با آزمایشگاه هماهنگی شود، تا از آماده بودن مقدمات آزمایش مطمئن شوید.
روش‌های آزمایشگاهی تشخیص بیماری
آزمایش آگلوتیناسیون میکروسکپی (Microscopic Agglutination Test) با استفاده آنتی‌ژن زنده سروتیپ‌های شایع لپتوسپیرا در منطقه، این آزمایش روش استاندارد WHO در تشخیص لپتوسپیروز معرفی گردیده است. تیتر 400/1 در نمونه اول خون و یا افزایش دو برابر تیتر در نمونه دوم نشانه قطعی بیماری است.
- کشت نمونه های مرضی (خون یا ادرار) در محیط اختصاصی
- آزمایش پادتن‌های درخشان (IFA (Indirect Flurscent Antibody
- آزمایش مستقیم نمونه‌های مرضی به کمک میکروسکپ زمینه تاریک
- تکنیک PCR) Polymerase Chane Reaction)
- تکنیک REA Restriction Endonuclase Analysis جهت تشخیص ژنوتیپ سویه‌های جدا شده
- روش الیزا ELISA
- تزریق به حیوانات آزمایشگاهی
روش‌های باکتریولوژیک (Bacteriologic Methods) در تشخیص لپتوسپیروز
تهیه محیط کشت:
1) محیط کورتف (Kortof’s Medium): مواد زیر در 920 میلی‌لیتر آب مقطر حل شود:
Pepton ...................................... 0.8 gr
NaCl ......................................... 1.4 gr
NaHCO3 ................................ 0.02 gr
Kcl .......................................... 0.04 gr
CaCl2 ..................................... 0.04 gr
KH2PO4 ................................. 0.24 gr
Na2 HPO4 .............................. 0.88 gr
به مدت 20 دقیقه آنها را بجوشانید سپس یک شب در دمای 4 درجه و بعد آن را فیلتر کرده و سپس اتوکلاو نموده و 8 تا 10% سرم خرگوش استریل غیرفعال شده به آن افزوده و pH نهایی را به 4/7 می‌رسانیم.
2) محیط فلتچر (Fletcher Mediu): مواد زیر در 920 میلی‌لیتر آب مقطر حل شود:
Peptone ................................. 0.3 gr
Beef Extract ........................... 0.2 gr
NaCl ....................................... 0.5 gr
Agar ....................................... 1.5 gr
محلول فوق را به مدت 15 دقیقه در دمای 121 درجه اتوکلاو نموده و 8 تا 10% سرم خرگوش استریل غیرفعال شده به آن افزوده و pH نهایی را به4/7 می‌رسانیم.
3) محیط استوارت (Stuart’s Medium): مواد زیر در 995 میلی‌لیتر آب مقطر حل شود:
Asparagine .......................... 0.132 gr
NH4Cl .................................. 0.268 gr
MgCl2-6H2O ....................... 0.406 gr
NaCl .................................... 1.808 gr
Na2 HPO4 ........................... 0.666 gr
KH2PO4 .............................. 0.087 gr
Phenol red ............................. 0.01 gr
Glycerine ................................ 5.0 ml
محلول فوق را به مدت 15 دقیقه در دمای 121 درجه اتوکلاو نموده و 8 تا 10% سرم خرگوش استریل غیرفعال شده به آن افزوده و pH نهایی را به 7.4 می‌رسانیم.
4) محیط اختصاصی EMJH که به صورت تجاری توسط شرکت دیفکو و یا شرکت BBL تهیه و توزیع می‌گردد.
5) محیط اختصاصی GRA Sina که در آزمایشگاه تحقیقاتی لپتوسپیروز تهیه می‌گردد و اکنون جایگزین محیط EMJH شده و بشکل‌های مایع و نیمه جامد همراه با آنتی‌بیوتیک جهت جداسازی باکتری در فیلد مورد استفاده قرار می‌گیرد و از کارایی بسیار خوبی برخوردار می‌باشد. در صورت نیاز می‌توانید سفارش خرید این محیط را به آزمایشگاه تحقیقاتی لپتوسپیروز ارسال نمایید.
برای مطالعه بخش‌های تکمیلی این مطلب کلیک کنید: بیماری لپتوسپیروز (Leptospirosis)