جمع آوری و کشت نمونه ها جهت تشخیص بروسلا

به گزارش «سرویس دام، طیور و آبزیان» «ماکی دام - پایگاه خبری صنعت دام، طیور و آبزیان»؛ جهت تشخیص بیماری و شناسایی جرم بوسلا نیاز به برداشت نمونه‌هایی از دام است که به آزمایشگاه فرستاده می‌شوند، در این بخش می‌پردازیم به معرفی نمونه‌های موردنیاز و نحوه برداشت آنها.

ادامه از خبر: راه‌های تشخیص و شناسایی جرم بروسلا

3) جمع‌آوری و کشت نمونه‌ها جهت تشخیص بروسلا

برای اینکه بتوان ابتلا به بروسلوز را در دام‌ها به‌وسیله کشت تشخیص داد، انتخاب نمونه‌ها معمولاً بستگی به نشانی‌های بالینی در دام موردنظر دارد. با ارزش‌ترین نمونه‌هایی که می‌توان جمع‌آوری کرد شامل جنین‌های سقط شده (محتویات شیردان، طحال و ریه)، پرده‌های جنینی، ترشحات واژن (که به‌وسیله سوآب جمع‌آوری می‌شود)، شیر، منی و مایعات آرتریت یا هیگروما می‌باشد.

برای انتخاب نمونه‌های بافتی از لاشه دام، نمونه‌های ترجیحی از بافت‌های مربوط به سیستم رتیکولواندوتلیال (مانند طحال و گره‌های لمفاوی سر، پستان و دستگاه تناسلی) می‌باشد.

همچنین در اواخر آبستنی یا در اوایل پس از زایش، نمونه‌های بافتی ترجیحاً شامل رحم و پستان می‌باشند. به‌طور معمول رشد کلونی‌ها 4-3 روز بعد از کشت صورت می‌گیرد، اما تا وقتی که 10-8 روز از زمان کشت دادن نگذشته باشد نباید نتیجه را منفی اعلام کرد.

نمونه‌های بافتی

جابه‌جایی نمونه‌ها باید به‌طور سترون و با استفاده از ابزار سترون صورت گیرد. باید برای تهیه نمونه‌های بافتی مواد اضافی را از آن‌ها حذف کرد (مانند چربی). بافت‌ها را باید به قسمت‌های کوچک برش داد.

سپس باید قبل از اینکه در محیط جامد تلقیح شوند، با استفاده از stomacher یا دستگاه جداکننده بافت (tissue ginder)، نمونه‌ها را در بافر سالین فسفات سترون خیساند.

ترشحات واژن

یک منبع عالی برای جداسازی بروسلا، سوآب واژن است که بعد از سقط یا بعد از زایمان تهیه می‌شود، که نسبت به جمع‌آوری نمونه‌های سقطی خطر کم‌تری برای افراد ایجاد می‌کند. سوآب آغشته به ترشحات واژن روی محیط جامد تلقیح می‌شود.

شیر

نمونه شیر باید به‌صورت بهداشتی تهیه شود و قبل از جمع‌آوری، لازم است پستان‌ها شسته و خشک شوند و سرپستانک‌ها ضدعفونی شوند. نمونه‌ها باید از همه کارتیه‌ها اخذ شوند و از هر سر پستانک 20-10 میلی‌لیتر شیر جمع‌آوری گردد.

اولین دوشش شیر را باید دور ریخت، سپس نمونه تهیه شده مستقیماً داخل مخازن سترون ریخته می‌شود. باید مراقب بود که نمونه شیر با دست شیردوش تماس مستقیم پیدا نکند.

شرایط سانتریفوژ کردن شیر باید طوری باشد که از آلوده شدن آئروسل‌ها و درنتیجه آلودگی افراد در معرض جلوگیری شود. خامه و رسوب چه به‌صورت جداگانه و چه به‌صورت مخلوط، بر روی محیط انتخابی جامد قرار داده می‌شود.

در نمونه‌های تانک شیر، تعداد بروسلا کم است و امکان دارد جداسازی آن موفقیت‌آمیز نباشد.

محصولات لبنی

محصولات لبنی نیز باید در محیط کشتی که در بالا توضیح داده شد، کشت داده شوند. این محصولات حاوی تعداد کمی جرم هستند بنابراین توصیه می‌شود محیط کشت آن‌ها غنی شود.

قبل از کشت، نمونه‌ها باید به دقت همگن شوند. پس از اینکه نمونه‌ها در دستگاه جداکننده بافت (tissue ginder) قرار داده شد، خیس شده و در stomacher یا مخلوط کن برقی پودر می‌گردد و حجم مناسبی از PBS سترون به آن افزوده می‌شود.

کشت باید از لایه‌های سطحی و قسمت‌های مرکزی محصولات لبنی صورت گیرد. به همان نسبت که بروسلا‌ها به‌سرعت رشد می‌کنند، به سرعت نیز ازبین می‌روند. توزیع بروسلا‌ها بسته به شرایط و روش فیزیکی شیمیایی که محصول لبنی تولید می‌شود، متفاوت است.

تمام نمونه‌ها را باید بلافاصله پس از جمع‌آوری سرد شوند و به نزدیک‌ترین آزمایشگاه منتقل شوند. در آزمایشگاه اگر نمی‌خواهیم نمونه‌های بافتی و شیر را بلافاصله کشت دهیم باید آن‌ها را منجمد کنیم.

بهتر است از به کار بردن حیوانات آزمایشگاهی مگر در موارد ضروری اجتناب کرد اما گاهی تنها وسیله برای تشخیص بروسلا این حیوانات هستند، به‌خصوص وقتی که میزان بروسلا در نمونه موجود کم باشد.

تلقیح به خوکچه هندی ازطریق زیرجلدی یا خراش جلد است و یا به‌صورت داخل رگی یا داخل صفاقی به موش تلقیح شود. در این روش باید اصول ایمنی به‌خوبی رعایت شود. طحال موش 7 روز پس از تلقیح کشت داده می‌شود.

در مورد خوکچه هندی ابتدا نمونه سرمی در هفته‌های 3 و 6 پس از تلقیح مورد آزمایش قرار می‌گیرد و بعد از طحال حیوان کشت تهیه می‌شود.

آزمایش شیر

یک روش مؤثر در غربالگری گله‌های شیری، آزمون تانک شیر است. گاو‌هایی که در اواخر آبستنی قرار دارند و خشک شده‌اند، در آزمون تانک شیر شرکت داده نمی‌شوند. در مورد این حیوانات در صورت آلودگی، با انجام آزمایش‌های سرم‌شناسی، احتمال مثبت شدن نتیجه بسیار بیشتر است.

بلافاصله پس از زایش، لازم است که تانک شیر مجدداً مورد آزمایش قرار گیرد. این روش ارزان است و امکان تکرار آن نسبت به انجام آزمون بر روی نمونه خون بیشتر است.

هنگامی‌که نتیجه آزمایش مثبت شد، تمامی گاو‌هایی که در مورد آن‌ها آزمون شیر صورت می‌گیرد، باید آزمون خون نیز در مورد آن‌ها صورت گیرد.

آزمون الایزای غیرمستقیم شیر دارای حساسیت و ویژگی بالایی است و به‌خصوص برای گله‌های بزرگ کاربرد دارد. در مواقعی که امکان استفاده از الایزا نیست، آزمایش حلقه شیر، یک روش مناسب می‌باشد.

آزمایش حلقه شیر

برای غربالگری دام‌های شیروار گله می‌توان از آزمایش حلقه شیر (MRT) استفاده نمود. در گله‌های بزرگ (با بیش از 100 رأس گاو شیری)، حساسیت این آزمون قابل اطمینان نیست.

گاهی از MRT برای جبران رقیق‌سازی نمونه‌های تانک شیر در گله‌های بزرگ استفاده می‌شود. نمونه‌ها براساس فرمول زیر تهیه می‌شوند:

در گاو‌هایی که 4 ماه قبل از آزمایش واکسینه شده‌اند و همینطور در نمونه‌هایی که حاوی شیر‌های غیرطبیعی (مانند آغوز) هستند یا در موارد ورم پستان، نتایج مثبت کاذب به وجود می‌آید.

بنابراین توصیه می‌شودکه از این آزمون در مورد گله‌های کوچک استفاده نشود، چراکه باعث خسارات زیادی در گله می‌شود.

روش آزمایش

این آزمایش بر روی نمونه‌های تانک شیر صورت می‌گیرد. درصورت لزوم باید نمونه‌ها را با استفاده از نگه‌دارنده (0/1 درصد فرمالین یا 0/02 درصد برونوپول) به مدت 3-2 روز در دمای 4 درجه سانتی‌گراد عمل‌آوری نمود.

1) نمونه‌های شیر و آنتی‌ژن‌ها را به اتاقی با دمای 3± 20 درجه سانتی‌گراد منتقل کنید. آنتی‌ژن‌ها را باید فقط در روز آزمایش از یخچال بیرون آورید.

2) ظرف حاوی آنتی‌ژن را به‌خوبی تکان دهید.

3) برای انجام آزمایش، 50-30 میکرولیتر از آنتی‌ژن را به 2-1 میلی‌لیتر شیر کامل اضافه کنید (حجم نمونه شیر تهیه شده از تانک شیر در مورد گله‌های بزرگ‌تر باید بیشتر باشد).

4) ارتفاع شیر در لوله، حداقل باید 25 میلی‌متر باشد. باید از حرارت دادن، منجمد کردن، تکان دادن و نگهداری نمونه‌های شیر به مدت بیش از 72 ساعت خودداری نمود.

5) به‌طور معمول باید مخلوط نمونه‌های شیر و آنتی‌ژن، در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 ساعت به همراه محلول‌های کار مثبت و منفی، گرمخانه‌گذاری شوند. با این وجود، گرمخانه‌گذاری به‌‌مدت یک شبانه روز در دمای 4 درجه سانتی‌گراد، حساسیت آزمایش را افزایش و قرائت نتایج را آسان‌تر می‌سازد.

6) تشکیل یک حلقه به رنگ آبی تیره در بالای ستون سفید رنگ شیر، نشان‌دهنده واکنش مثبت قوی است. وجود هر لایه آبی رنگ بر روی سطح شیر را باید موردتوجه قرار داد چراکه ممکن است نشان‌دهنده مثبت بودن نتیجه باشد (به‌خصوص در گله‌های بزرگ).

7) اگر رنگ شیر از کرم تجاوز کند، نشان‌دهنده منفی بودن آزمایش است.

8) زمانی که MRT برای گله‌های بزرگ صورت می‌گیرد 2 یا 3 میلی‌لیتر شیر مورد استفاده قرار می‌گیرد.