به گزارش «سرویس دام، طیور و آبزیان» «ماکی دام - پایگاه خبری صنعت دام، طیور، آبزیان و حیوانات خانگی»؛ برای انجام آزمایش‌های تشخیصی دقیق باید جنین به‌طور کامل به آزمایشگاه ارسال شود، زیرا عوامل پیچیده‌ای سبب این بیماری و سقط می‌شود.
نمونه‌ها جهت تأیید تشخیص
- نمونه‌های بافت‌شناسی: نمونه از محوطه دهانی، زخم‌های مری، تیموس، کولون، پلاک‌های پایر، شیردان، شکمبه، گره‌های لمفاوی روده بند، قلب و گوش.
- نمونه‌های بافت‌شناسی جنین سقط شده شامل: ریه، تیموس، طحال، روده، کبد، کلیه، قلب، مغز و چشم (جهت مشاهده با میکروسکوپ نوری و ایمونوهیستوشیمی) می‌باشد. نمونه‌های مذکور باید در فرمالین ثابت شوند.
- نمونه‌های ویروس شناسی: تیموس، تیروئید، طحال، ریه، گره‌های لمفاوی روده بند، پلاک‌های پایر. (ISO، آزمون فلئورسنت آنتی‌بادی (PCR)
- از نمونه‌های خون، سرم (جهت کشت و آزمون خنثی‌سازی آنتی‌بادی) و محتویات روده نیز می‌توان استفاده نمود.
جداسازی ویروس
می‌توان ویروس را در تعدادی از کشت‌های سلولی تک‌لایه گاوی (مانند کلیه، ریه، بیضه یا شاخک‌های بینی) جداسازی نمود. رشد هر دو بیوتیپ خوب است. یکی از آلودگی‌های رایج بافت‌های تازه گاوی، ویروس‌های غیرسیتوپاتوژنیک BVD است و کشت‌های سلولی باید از جهت آلوگی با ویروس توسط آزمایش‌های منظم بررسی شوند.
کشت‌های اولیه و ثانویه را می‌توان به‌صورت سوسپانسیون سلول در نیتروژن مایع منجمد نمود. می‌توان با انجام بیش از یکسری پاساژ، آزمایش را تکرار کرد، یا در سوسپانسیون سلول‌های دیگر سید شود و قبل از استفاده از آن، بررسی شود.
می‌توان با استفاده از رده‌های سلولی ادامه‌دار که عاری از BVD هستند این مشکل را حل نمود. سرم جنین گاوی که در کشت‌های سلولی کاربرد دارد نه تنها باید عاری از ویروس باشد، بلکه باید فاقد آنتی‌بادی‌های خنثی‌کننده ویروس BVD نیز باشد.
حرارت دادن ( 56 درجه سانتی‌گراد به مدت 45-30 دقیقه) برای تخریب ویروس BVD در سرم آلوده مناسب نمی‌باشد، به‌خصوص با پرتودهیkiloGray 25 (Mrad 2/5).
بسته‌های تجاری سرم جنین گاو، به خوبی آلودگی را در PCR نشان می‌دهند (حتی وقتی ویروس توسط پرتودهی غیرفعال می‌شود). می‌توان از سرم اسب نیز استفاده نمود، اما باعث رشد ضعیف سلول‌ها می‌شود.
سلول‌های بافی کوت، خون کامل، لکوسیت‌های شسته شده یا سرم برای جداسازی ویروس از دام زنده مناسب می‌باشند. در گوساله‌های جوان، حضور آنتی‌بادی‌های مادری ممکن است با جداسازی ویروس تداخل داشته باشد.
باید سوسپانسیون‌های بافتی که از دام‌ها پس از مرگشان تهیه شده است، با روش‌های استاندارد آماده‌سازی شوند. می‌توان منی را نیز بررسی نمود، اگرچه جمع‌آوری نمونه خون از گاو نر ترجیح داده می‌شود.
گزارشی درمورد گاو نری که ویروس BVD را ازطریق منی دفع می‌کرده اما ویرمیک نبوده است وجود دارد. منی سیتوتوکسیک بوده و باید در محیط کشت رقیق شود.
منی رقیق شده، معمولاً به‌طور مستقیم روی سلول‌های تک لایه تلقیح می‌شود، اما ممکن است گاهی اثرات سیتوتوکسیک ایجاد کند. بنابراین بررسی سلول‌ها با میکروسکوپ و در فواصل بین گرم‌خانه‌گذاری‌ها، اهمیت ویژه‌ای دارد.
روش‌های مختلفی برای جداسازی ویروس وجود دارد و همگی باید از حداکثر حساسیت جهت تشخیص ویروس استاندارد برخوردار باشند، که می‌تواند شامل یک یا تعداد بیشتری پاساژ در محیط آزمایشگاه باشد.
روش‌های معمول جداسازی ویروس با آخرین روش‌های ایمنی (فلئورسنس یا آنزیماتیک) برای تشخیص رشد ویروس‌های غیرسیتوپاتیک، استفاده می‌شوند. بنابراین، لوله‌های کشت باید روی flying cover slip باشند، در حالی‌که پلیت‌های کشت را می‌توان ثابت و به‌طور مستقیم به پلیت چسباند.
آزمون‌های سرم‌شناسی
می‌توان آنتی‌بادی‌های ضد BVDرا در سرم گاو و با استفاده از آزمون استاندارد خنثی‌سازی ویروس یا الایزا، شناسایی نمود. کنترل مثبت و منفی سرم استاندارد را باید در تمامی آزمون‌ها استفاده کرد.
برای بررسی وضعیت BVD در گله، آزمون الایزا جهت تشخیص آنتی‌بادی در نمونه‌های تانک شیر، مناسب می‌باشد. یک الایزای با ارزش با واحد‌های جذبی 0/1 یا بیشتر، مشخص می‌کند که به احتمال زیاد اخیراً گله در معرض ویروس BVD قرار گرفته است و به احتمال بیشتر، دام‌های مقاوم ویرمیک درگله حضور دارند.
در مقابل ارزش کم یا منفی (0/2 ≥)، مشخص می‌کند که احتمال حضور دام‌های مقاوم ویرمیک غیرممکن است. دسته‌بندی‌های دیگر نیز وجود دارد که ارزش آن‌ها متوسط است، که بستگی به نوع سیستم دامپروری دارد.
مشخص شده است که الایزا برای تشخیص دام‌های مقاوم در گله و بررسی حضور آنتی‌ژن‌های ویروس در تانک شیر، آزمون معتبری نیست و ممکن است با آزمون آنتی‌بادی الایزا تداخل کند.
پیشنهاد می‌شود که وضعیت آنتی‌بادی تعداد کمی‌از دام‌های جوان گله (18-9 ماه) بررسی شود تا مشخص گردد که آیا گله اخیراً در معرض ویروس BVD بوده است یا خیر، اما این بستگی به درجه تماس بین گروه‌های مختلف دام‌های گله دارد.
می‌توان از روش Rapid spot test برای غربال‌گری اولیه به‌عنوان بخشی از طرح‌های کنترل و ریشه‌کنی BVD استفاده نمود.
روش کشت
هر دو بیوتیپ در کشت‌های سلولی متنوعی با منشأ گاوی، رشد می‌کنند. انتظار ما از روش‌های استاندارد این است که بتوان ویروس غیرسیتوپاتیک را در روز 7-5 و ویروس سیتوپاتیک را در روز 4-2 برداشت کرد.
نتایج مطلوب بستگی دارد به عوامل مختلفی چون کشت سلول، روش جداسازی و میزان بذر اولیه ویروس.