به گزارش «سرویس دام، طیور و آبزیان» «ماکی دام - پایگاه خبری صنعت دام، طیور و آبزیان»؛ نمونه‌ها جهت آزمایش‌های باکتری‌شناسی: کلیه، کبد و جفت به صورت منجمد (برای انجام آزمایش‌های فلئورسنت آنتی‌بادی، PCR، کشت)
نمونه‌های بافت‌شناسی (نمونه‌ها باید در فرمالین ثابت شوند): کلیه، کبد، مغز، قلب، ریه، جفت (جهت بررسی با میکروسکوپ نوری و آزمون هماگلوتیناسیون غیرمستقیم)
نمونه‌ها جهت آزمایش‌های سرم‌شناسی: قلب (سرم خون قلب یا مایعات پریکارد جنین) جهت آزمون آگلوتیناسیون میکروسکوپیک: کلیه، کبد، ریه و...، مایعات جنینی شامل: زلالیه، مایعات صدری، مایعات صفاقی، مایعات پریکارد و....، جفت
5-10 گرم از هریک از بافت‌ها و یا تعداد 6-5 کوتیلودون باید به‌صورت سترون جمع‌آوری شوند. سپس نمونه‌ها باید در ظروف حاوی 100 میلی‌لیتر سرم آلبومین گاوی 1% رقیق شده (1 گرم BSA در 100 میلی‌لیتر بافر فسفات {Na2HPO41/ mg664+ 1/ mg {KH2PO487 که شامل μg/ml 200 5- فلورویوراسیل است) به‌صورت سترون قرار داده شوند.
نمونه‌های خون را باید تا آنجایی که می‌توان از تعداد زیادی از میش‌ها اخذ کرد (حداقل 10 میش) و باید تا آنجا که می‌توان نمونه‌ها بلافاصله بعد از سقط جمع‌آوری شوند.
نمونه‌های خون را می‌توان از جنین سقط شده نیز برداشت کرد. نمونه‌های خون باید در لوله‌های شیشه‌ای سترون که فاقد ماده ضد انعقاد است جمع‌آوری گردند.
تمامی نمونه‌ها باید در دمای 4 درجه سانتی‌گراد و در اسرع وقت به آزمایشگاه ارسال شوند.
روش کشت
هر جزء سویه که در آخرین واکسن وجود دارد، باید به‌صورت جداگانه در محیط مایع (ترجیحاً فاقد پروتئین یا با پروتئین کم) رشد داده شوند. حجم هر کشت master seed با رشد در یکسری ساب کالچر با دمای 1 ±29 درجه سانتی‌گراد و به مدت 10-2 روز تا یک حجم کافی باید تقویت شود. کشت‌ها را باید تا آنجا که لازم است تکان داد و هوادهی کرد.
هر ساب کالچر از کشت master seed باید ازجهت خلوص و رشد مناسب بررسی شود. برای بررسی خلوص، می‌توان به اندازه یک لوپ از کشت به پلیت بلاد آگار یا براث تیوگلیکولات تلقیح کرد و به مدت 5-2 روز در دمای 37-35 درجه سانتی‌گراد گرم‌خانه گذاری نمود.
سپس یک گسترش از رسوب کشت با روش گرم رنگ‌آمیزی میشود. به‌وسیله میکروسکوپ زمینه تاریک می‌توان وضعیت رشد را بررسی نمود. تولید کشت seed باید با آنتی‌سرم خرگوش مشابه خودش، برای اطمینان از خلوص و هم‌سانی آزمایش شود که برای این منظور می‌توان از MAbs استفاده نمود.
آزمون‌های سرم‌شناسی
آزمون‌های سرم‌شناسی بیشترین استفاده را در تشخیص لپتوسپیروز دارند و آزمون آگلوتیناسیون میکروسکوپیک (MAT)، آزمایش سرم‌شناسی استاندارد می‌باشد.
آنتی‌ژن‌های انتخاب شده برای MAT باید شامل سویه‌هایی باشد که نماینده گروه سرمی موجود در ناحیه خاص است، بعلاوه آنتی ژن‌هایی که به‌وسیله گونه‌های میزبان نگهداری می‌شوند.
MAT هم برای آزمایش بر روی دام‌ها به‌صورت انفرادی استفاده میشود و هم برای آزمایش گله.
MAT برای آزمایش انفرادی دام‌ها جهت تشخیص عفونت بسیار مفید است: با این روش عیار آنتی‌بادیی نمونه‌های سرم دام‌هایی که به شکل حاد بیماری مبتلا هستند و همچنین نمونه‌های سرم دام‌هایی که در دوره نقاهت بیماری به‌سر می‌برند، چهار برابر افزایش می‌یابد.
برای دست‌یابی به اطلاعات مفید از یک گله، باید حداقل 10 دام یا 10% گله، مورد آزمایش قرار بگیرند. همچنین باید سابقه واکسیناسیون دام‌ها بررسی و ثبت شود.
در آزمایش انفرادی دام‌ها، تشخیص شکل مزمن عفونت و در گله شکل بومی آلودگی به کمک MAT دارای یکسری محدودیت‌هایی می‌باشد. دام‌های آلوده ممکن است سقط کنند و یا جرم را ازطریق کلیه و دستگاه تناسلی خود دفع کنند. در این دام‌ها عیار MAT کمتر از حداقل عیار قابل قبول (1/100) می‌باشد (رقت نهایی).
جهت تشخیص آنتی‌بادی‌های ضدلپتوسپیروز روش الایزا می‌تواند مفید باشد. آزمایش‌های زیادی برای تشخیص آلودگی‌های اخیر و غربالگری دام‌هایی که به‌طور تجربی در مطالعات استفاده می‌شوند، توسعه یافته است و به‌طور اولیه مورد استفاده قرار می‌گیرد.
دام‌هایی که علیه سروواری واکسینه شده‌اند، گاهی در آزمون الایزا مثبت می‌شوند و تفسیر نتایج را پیچیده می‌کند.
الف) آزمون آگلوتیناسیون میکروسکوپیک
رایج‌ترین آزمون سرم‌شناسی مورد استفاده MAT می‌باشد که در آن از آنتی‌ژن‌های زنده استفاده می‌گردد.
این روش در مقابل سایر آزمون‌های سرم‌شناسی، یک آزمایش مرجع است که از آن برای آزمون‌های واردات و صادرات استفاده میشود. برای ایجاد حساسیت مناسب، باید از آنتی‌ژن‌هایی استفاده کرد که نماینده تمامی گروه‌های سرمی شناخته شده در منطقه بوده و ترجیحاً سویه‌ها نماینده همه گروه‌های سرمی باشند.
معمولاً شناسایی یک گروه سرمی با استفاده از واکنش‌های متناوب در غربالگری سرم‌شناسی صورت می‌گیرد، اما برای شناسایی قطعی از جداسازی یک سرووار از دامی که دارای علائم بالینی است استفاده می‌گردد.
می‌توان با جداسازی ناحیه‌ای به‌جای سویه‌های مرجع، حساسیت آزمون را افزایش داد. اما سویه‌های مرجع به تفسیر نتایج در بین آزمایشگاه‌ها کمک می‌کنند.
ویژگی MAT خوب است. آنتی‌بادی‌های علیه سایر باکتری‌ها معمولاً با آنتی‌بادی‌های علیه لپتوسپیرا واکنش متقاطع ندارند، با این حال، به‌طور مشخصی واکنش متقاطع سرم‌شناسی بین سرووار‌ها و گروه‌های سرمی لپتوسپیرا وجود دارد و دامی که با یک سرووار آلوده شده است، دارای آنتی‌بادی‌هایی است که با آنتی‌بادی‌های علیه سایر سرووار‌ها در آزمون MAT واکنش متقاطع ایجاد می‌کند (معمولاً در سطح پایین).
بنابراین، در عفونت‌های انفرادی یا در همه‌گیری‌ها نمی‌توان از آزمون‌های سرم‌شناسی جهت تشخیص قطعی استفاده کرد و در این موارد باید از روش‌های جداسازی جرم استفاده نمود. به هرحال، در مناطقی که سرووار‌های لپتوسپیرا به‌خوبی تشخیص داده شده است، می‌توان از روش‌های جداسازی و آزمایش‌های سرم‌شناسی دام‌های آلوده استفاده نمود، اما نه برای تشخیص قطعی سرووار عفونی.
علاوه براین، دام‌هایی که در برابر لپتوسپیروز واکسینه شده‌اند، ممکن است دارای آنتی‌بادی علیه سرووار موجود در واکسن مورد استفاده باشند. بنابراین، توجه به سابقه واکسیناسیون دام‌های مورد آزمایش اهمیت زیادی دارد.
سویه‌های انتخاب شده باید در محیط کشت مایع لپتوسپیرا (مانند EMJH ،Tween 80 BSA یا سایر محیط های انتخابی) و در دمای 1 ±29 درجه سانتی‌گراد رشد کند. همچنین کشت باید حداقل 4 روزه باشد اما بیشتر از 8 روز نباشد.
از کشت‌های زنده با تراکم تقریباً 108 × 2 لپتوسپیرا به‌ازای هر میلی‌لیتر به عنوان آنتی‌ژن استفاده میشود. می‌توان با شمارش مستقیم سلول‌ها با استفاده از محفظه شمارش باکتری و میکروسکوپ زمینه تاریک، تراکم کشت را مشخص نمود.
شمارش سلول‌ها را می‌توان به‌طور متناوب با استفاده از اندازه‌گیری پراکنش در اسپکتروفوتومتر با فیلتر 400 نانومتر یا با نفلومتری تخمین زد.
اگر از روش‌های غیرمستقیم استفاده شود، لازم است شمارش مستقیم سلول باکتریایی اصلاح شود و ممکن است یک آزمون غربالگری با سرمی به رقت 1/50 (یا یک رقت آغازین متفاوت براساس هدف آزمایش) صورت پذیرد.
هم حجم سرم رقیق شده، آنتی‌ژن به هر چاهک اضافه میشود، که رقت سرم نهایی در آزمون غربالگری 1/100 میشود. پلیت‌های میکروتیتراسیون در دمای 1±29 درجه سانتی‌گراد و به مدت 4-2 ساعت گرم‌خانه گذاری می‌شوند. پلیت‌ها با میکروسکوپ زمینه تاریک بررسی می‌شوند.
نقطه پایانی، رقتی از سرم است که 50% آگلوتیناسیون را نشان دهد، 50% سلول‌های آزاد با کشت کنترل با رقت ½ در بافر فسفات سالین مقایسه میشود. نتیجه آزمون به عنوان رقت نهایی سرم (مثلاً 1/100 یا 1/400) یا متقابلاً به‌صورت عیاری که رقت نهایی سرم است (مثلاً 100 یا 400 )، گزارش میشود.
بسیاری از آزمایشگاه‌ها یک آزمون غربالگری را در یک رقت نهایی سرم انجام می‌دهند که از 1/100 شروع میشود تا بالاتر.
در MAT، شناسایی آنتی‌ژن‌ها اهمیت زیادی دارد. ارزیابی آنتی‌ژن‌ها با استفاده از سرم فوق ایمن خرگوش، MAbs، یا روش‌های مولکولی با چند مرتبه پاساژ صورت می‌گیرد، که بهتر است این کار در هر بار آزمایش، انجام گیرد، اما حداقل دو بار در سال باید صورت پذیرد.
سرم فوق ایمن خرگوش را می‌توان از یک آزمایشگاه مرجع تهیه نمود و یا از پروتکل‌هایی مانند کمیته فرعی طبقه‌بندی لپتوسپیرا تهیه نمود. به‌طور خلاصه می‌توان از خرگوش‌های سالم با وزن 4-3 کیلوگرم که فاقد آنتی‌آنتی‌بادی‌های قابل شناسایی لپتوسپیرا هستند، استفاده کرد.
از ورید حاشیه ای (مارژینال) گوش هر خرگوش خون‌گیری میشود و از یک کشت زنده با رشد خوب یا کشت کلون شده‌ای که به آن فرمالین افزوده شده است، استفاده میشود که دارای تراکم تقریباً 108 ×2 لپتوسپیرا در هر میلی‌لیتر می‌باشد.
کشت در محیط Tween 80 BSA یا یک محیط مناسب دیگر باید رشد نماید. 5 تزریق ml 1 و 2 ml 6 ،ml 6 ،ml 4 ،1ml با فواصل 7 روز انجام می‌گیرد. یک هفته بعد از تزریق، عیار آنتی‌بادی‌های مشابه با استفاده از MAT مشخص میشود.
اگر عیار ≥ 800، 1/12 بود، 7 روز بعد خرگوش را بیهوش کرده و با سوراخ کردن قلب خون‌گیری می‌کنیم (یا 14 روز بعد از آخرین تزریق). اگر عیار < 800، 1/12 باشد، می‌توان یک تزریق شش میلی‌لیتری دیگر از کشت انجام داد. 7 روز پس از این تزریق مجدداً عیار مشابه مشخص میشود.
مگر اینکه عیار≥ 800، 1/12 باشد که در این صورت روش مذکور باید دوباره با یک خرگوش دیگر انجام پذیرد. برای آماده‌سازی هر آنتی‌سرم از دو خرگوش استفاده میشود. اگر عیار‌ها در هر دو خرگوش مناسب بود، سرم‌ها با هم مخلوط می‌شوند.
بهتر است که آنتی‌سرم‌ها را با حجم 2 میلی‌لیتر برای حفظ قدرتشان به‌صورت خشک منجمد نموده و در دمای 5-2 درجه سانتی‌گراد ذخیره کنیم. متناوباً می‌توان سرم‌ها را در حجم 2 میلی‌لیتر و در دمای 15 تا 20 درجه سانتی‌گراد ذخیره نمود.
سایر روش‌های ایمن‌سازی که براساس استفاده از آنتی‌سرم‌های تأیید شده هستند نیز موردتوجه قرار می‌گیرند.
خلوص آنتی ژن‌های مورد استفاده در MAT باید با کشت منظم بر روی بلاد آگار و براث تیوگلیکولات، مورد ارزیابی قرار گیرد. کشت‌های ذخیره آنتی‌ژن‌ها در دمای 70- تا 80- درجه سانتی‌گراد در ازت مایع ذخیره می‌شوند.
در ازت مایع ممکن است میزان لپتوسپیرا‌های زنده بعد از لیوفیلیزه کردن کاهش پیدا کند. پاساژ مجدد آنتی‌ژن‌ها در محیط مایع باعث ازدست رفتن قدرت آنتی ژن‌ها می‌گردد، که در این موارد باید یک کشت مایع جدید از کشت استاک تهیه شود.
MAT در آزمایش انفرادی دام‌ها، روش بسیار مفیدی می‌باشد. در نمونه‌های سرم دام‌های که دچار عفونت حاد بوده یا نمونه سرم دام‌هایی که در دوره نقاهت بیماری هستند، افزایش 4 برابری در عیار آنتی‌بادی قابل شناسایی است.
علاوه براین، احتمالاً تشخیص لپتوسپیروز براساس عیار‌های خیلی بالا در دام‌هایی است که دارای چهره بالینی ثابتی هستند. این آزمایش در تشخیص عفونت‌های مزمن، سقط جنین و همینطور حاملینی که جرم را ازطریق کلیه یا دستگاه تناسلی دفع می‌کنند، دارای محدودیت می‌باشد.
این مسئله به‌خصوص در عفونت‌های عادت یافته به میزبان صدق می‌کند. مانند سرووار هارجو در گاو: زمانی که عیار 1/100 یا بیشتر به‌عنوان نتیجه معنی‌دار مطرح میشود، حساسیت آزمون فقط 41% است و حتی زمانی که حداقل عیار معنی‌دار به 1/10 کاهش می‌یابد، حساسیت آزمایش تنها 67% می‌باشد.
می‌توان آنتی‌بادی‌های خون جنین را نیز شناسایی نمود، اما معمولاً عیار‌ها پایین است (مثلاً 1/10) و در بیشتر آزمایشگاه‌ها نیاز به اصلاح آزمون دارد.
از آنجا که لپتوسپیروز گله را درگیر می‌کند، MAT بیشتر به‌عنوان آزمونی در سطح گله مطرح می‌باشد.
Cole وهمکاران پیشنهاد دادند که برای اخذ اطلاعات مفید، نمونه‌ها از حداقل 10 دام یا 10% گله (هرکدام که بیشتر بودند) تهیه شوند. در مطالعه‌ای که عفونت هارجو را در گاو بررسی می‌کرد، Hathaway و همکاران متوجه شدند که معمولاً نمونه‌گیری از 10 گاو حضور یا عدم حضور عفونت را در گله مشخص می‌کند.
افزایش اندازه نمونه‌ها به بهبود اطلاعات همه‌گیرشناسی، تشخیص بیماری بالینی و سلامت عمومی کمک می‌کند.
در تشخیص سرم‌شناسی لپتوسپیروز باید به نوع سرووار و شرایط بالینی کاملاً توجه شود. در موارد سقط جنین ناشی از سرووار پومونا درگاو، معمولاً در زمان سقط عیار بالایی وجود دارد، چراکه علامت بالینی (سقط جنین) بلافاصله پس از عفونت ایجاد شده است.
سقط جنین ناشی از سرووار هارجو درگاو، یک رویداد مزمن است که در این موارد پاسخ سرم‌شناسی در زمان سقط متنوع است، به طوری‌که برخی از دام‌ها ازنظر سرمی منفی هستند، درحالی‌که سایرین عیار بالایی را نشان می‌دهند.
ممکن است در اثر عفونت در مرحله حاد ناشی از سرووار هارجو، تولید شیر گاو کاهش یابد، که این علامت بالینی با عیار‌های بالا همراه می‌باشد. در تفسیر نتایج MAT، باید سابقه واکسیناسیون مورد توجه قرار گیرد.
واکسیناسیون وسیع باعث افزایش تعداد دام‌هایی میشود که ازنظر سرمی مثبت هستند. در این صورت دام‌هایی که به صورت مزمن به خصوص با سرووار‌هارجو آلوده هستند تشخیص داده نمی‌شوند.
ب) الایزا
روش الایزا جهت شناسایی آنتی‌بادی‌های ضد لپتوسپیرا توسعه یافته است. الایزا از آنتی‌ژن‌ها، پروتوکل‌های سنجش و پلت فرم‌های سنجش استفاده می‌کند و شامل آزمون پلیت و آزمون نوار ادراری می‌باشد.
امروزه آنتی‌ژن‌های سطحی لپتوسپیرا شناسایی شده‌اند. الایزا دارای حساسیت بالایی است، اما به اندازه MAT ویژگی برای سرووار‌ها را ندارد. در الایزا IgM در عرض یک هفته پس از آلودگی (قبل از آگلوتیناسیون آنتی‌بادی‌ها) قابل شناسایی است.
IgG 2 هفته پس از آلودگی در سگ‌ها قابل شناسایی است و این آنتی‌بادی برای مدت طولانی باقی می‌ماند. بنابراین سگ‌های مبتلا به شکل حاد لپتوسپیروز دارای عیار بالای IgM و عیار پایین IgG هستند.
سگ‌های واکسینه و سگ‌هایی که قبلاً به لپتوسپیروز آلوده بوده‌اند دارای عیار بالای IgG و عیار پایین IgM هستند.
آزمون‌های مشابه دیگری نیز وجود دارد که برای تشخیص آنتی‌بادی‌های ضدلپتوسپیرا در گاو وگوسفند مورد استفاده قرار می‌گیرند. بزرگ ترین تفاوت نقش الایزا در دام‌های اهلی استفاده از IgM برای تشخیص آلودگی‌های جدید و برای غربالگری گله در منطقه‌ای که واکسیناسیون علیه لپتوسپیروز صورت نگرفته است، می‌باشد.
می‌توان از یک الایزای total-Ig برای شناسایی دام‌های حساس در کار‌های تجربی استفاده کرد. همچنین می‌توان از الایزا جهت شناسایی آنتی‌بادی‌های ضد سرووار هارجو در شیر گاو به‌صورت انفرادی یا در تانک شیر، استفاده نمود.
این آزمایش‌ها به تشخیص گله‌های آلوده به سرووار‌هارجو کمک می‌کنند. اما ممکن است گله‌هایی که علیه سرووار هارجو واکسینه شده‌اند در آزمون الایزا مثبت شوند، درنتیجه ارزش الایزا در مناطقی که واکسیناسیون به‌طور معمول رواج دارد، کاهش می‌یابد.
امروزه آزمون‌های الایزایی طراحی شده است که اساس آن‌ها شناسایی آنتی‌بادی علیه پروتئین‌ها یا لیپوپروتئین‌های سطحی لپتوسپیرا می‌باشد، اما این روش‌ها هنوز به‌طور گسترده در اختیار ما قرار ندارند.