ماکی دام

دام، طیور، آبزیان

کد خبر: 1722
بازدید: 1322
تاریخ انتشار: ۱۳۹۶/۲/۱۱ ساعت: 11:07:51 AM

بررسی الگوی مقاوت داروئی کلستریدیوم پرفرانژنس‌های جداسازی شده از طیورگوشتی

كلستریدیوم پرفرانژنس (clostridium perfringens) توكسین زای تیپ A و C باعث تورم روده نكروتیک (Necrotic enteritis) در طیور گوشتی شده از طرفی سبب انترتوكسین در انسان می‌شود.

کلستریدیوم پرفرنژنس‌

به گزارش «سرویس دام، طیور و آبزیان» «ماکی دام - پایگاه خبری صنعت دام، طیور و آبزیان»؛ هدف از این مطالعه: كلستریدیوم پرفرانژنس (clostridium perfringens) باسیل، گرم مثبت، ضخیم و كشیده، به صورت تكی یا دوتایی و به ندرت زنجیره‌ای است. كلستریدیوم پرفرانژنس توكسین زای تیپ A و C باعث تورم روده نكروتیک (Necrotic enteritis) در طیور گوشتی شده از طرفی سبب انترتوكسین در انسان می‌شود. هدف از انجام این تحقیق بررسی الگوی مقاوت داروئی كلستریدیوم پرفرانژنس‌های جداسازی شده از طیورگوشتی می‌باشد.

روش كار: در این مطالعه پس از جداسازی 17 جدایه كلستریدیوم پرفرانژنس از گله‌های گوشتی شهرستان كازرون به روش‌های Summanen وهمكاران درسال 1993؛ Quinn و همکاران 1994 و miller و همکاران در سال 1998؛ آزمایش آنتی‌بیوگرام به روش استاندارد Kirby _ Baurer انجام یافت.

نتایج: تمامی 17 جدایه كلستریدیوم پرفرانژنس در این بررسی نسبت به پنی‌سیلین، ونكومایسین و كلرامفنیكل حساسیتی از 79/5‌درصد تا 89‌درصد را داشتند؛ درحالی كه به تركیبات ضدباكتریایی تتراسایكلین، لینكومایسین، نئومایسین سولفات مقاومت دارویی از 71/3‌درصد تا 85/8‌درصد را نشان دادند. همچنین مشخص گردید تمامی جدایه‌ها به بیش از یک تركیب ضدباكتریایی مقاومت نشان می‌دهند.

نتیجه‌گیری: با توجه به مقاومت داروئی بالای كلستریدیوم پرفرانژنس‌های جداسازی شده قبل از تجویز آنتی‌بیوتیک انجام آزمایش آنتی‌بیوگرام الزامی می‌باشد.

بررسی الگوی مقاوت داروئی کلستریدیوم پرفرانژنس‌های جداسازی شده از طیورگوشتی
بیماری آنتریت نكروتیک، یكی از بیماری‌های باكتریایی در طیور می‌باشد. كه براثر كلستریدیوم پرفرانژنس ایجاد می‌شود؛ كلستریدیوم پرفرانژنس باسیل، گرم مثبت، ضخیم و كشیده، به صورت تكی یا دوتایی و به ندرت زنجیره‌ای است.

كلستریدیوم پرفرانژنس توكسین زای تیپ  A و C باعث تورم روده نكروتیک در طیور گوشتی شده، ازطرفی سبب انتروتوكسین در انسان می‌شود. در كشوری مانند ایران كه استفاده از آنتی‌بیوتیک‌های محرک رشد و كوكسیدیواستات‌های یونوفوره كه برباكتری‌های گرم مثبت اثر دارند متداول می‌باشد، وقوع بیماری دور از انتظار نیست. با این حال بروز بالینی این بیماری به خصوص در گله‌های گوشتی بسیار محدود می‌باشد. در مطالعه حاضر 15 جدایه كلستریدیوم پرفرانژنس كه از موارد بالینی بیماری جداسازی و خصوصیات میكروبی و بیوشیمیایی آن‌ها مشخص گردیده بود، الگوی مقاومت دارویی آن‌ها تعیین گردید.

تورم روده نکروتیک
تورم روده نکروتیک

مواد وروش كار:

برای جداسازی باكتری كلستریدیوم پرفرانژنس از لاشه طیور گوشتی، ابتدا سطح سروزی روده لاشه‌های مبتلا توسط تیغه اسپاتول داغ استریل گردید. سپس موضع به وسیله بیستوری استریل برش داده شد و توسط یک لوپ استریل مخاط روده تخریش و پس از تهیه گسترش میكروبی و انجام رنگ‌آمیزی گرم زیر میكروسكوپ مورد بررسی قرارگرفت شناسایی باكتری بر اساس روش‌های تشریح شده توسط Summanen و همکاران در سال 1993، Quinn و همکاران 1994 و Miller و همکاران در سال 1998 صورت پذیرفت.

درصورت مشاهده باسیل‌های گرم مثبت حاوی اسپور تشخیص احتمالی بر مبنای كلستریدیوم پرفرانژنس قرار می‌گرفت. برای جداسازی كلنی‌های خالص كلستریدیوم پرفرانژنس از نمونه‌هایی كه در رنگ‌آمیزی گرم مثبت بودند، برروی پلت آگار خون‌دار كشت خطی انجام شد (تمامی مراحل كشت در زیرهود آزمایشگاه و درمجاورت شعله انجام شد).

سپس پلیت‌های كشت شده به صورت وارونه در داخل جار بی‌هوازی (Anaerobic Jar, Merck, Germany) قرارداده شدند؛ سپس گاز پک A را (Anaerobic A , Merck) در داخل جار بی‌هوازی قرارگرفته و پس از بستن درب جار بی‌هوازی حاوی پلت آگار خون‌داركشت شده این جارها در انكوباتور در درجه حرارت 33 درجه سانتی‌گراد به مدت 20 ساعت قرار داده شدند. برای تایید شرایط بی‌هوازی از استریپ‌های اندیكاتور (Anaerotest, Merck) در هرجار استفاده شد؛ بعد از گذشت زمان فوق‌الذكر، درب جار بی‌هوازی باز شد و پلیت‌های آگار كشت داده شده زیر هود، در مجاورت شعله چراغ مورد بررسی قرار گرفتند.

مشاهده كلنی‌های بزرگ صاف و گرد به قطر 2تا 42میلی‌متر با همولیز دوگانه (همولیز كامل در ناحیه داخلی و همولیزناقص در ناحیه بیرونی) احتمال حضور كلستریدیوم پرفرانژنس را مطرح نمود. تعدادی از این كلنی‌ها انتخاب و پس از انجام رنگ‌آمیزی گرم زیر میكروسكوپ مورد بررسی قرار گرفتند تا مورفولوژی مورد انتظار مشاهده شود. برای تایید تشخیص ازمحیط‌های متعددی استفاده شد. نمونه‌ها احتمالاً مثبت به صورت خطی بر روی پلیت‌های آگار زرده تخم‌مرغ (Merck) كشت داده شدند.

پلیت‌های آگار زرده تخم‌مرغ كشت شده به مدت 48 ساعت تحت شرایط بی‌هوازی در 37 درجه سانتی‌گراد انكوبه گردیدند. باكتری‌های كلستریدیوم پرفرانژنس لسیتیناز تولید می‌كنند كه به صورت وجود كدورت و سفیدی در محیط اطراف كلنی باكتری كه دلیل بر فعالیت لیستیناز باكتری است، مشخص می‌شود.

آزمایش بعدی، تست برای عدم تولید لیپاز بود كه بر روی محیط كشت آگار زرده تخم‌مرغ صورت گرفت. از آنجایی كه این باكتری لیپاز تولید نمی‌كند درمحیط آگار زرده تخم‌مرغ واكنش مربوط به لیپاز یعنی تولید‌ هاله در اطراف كلنی باكتری كلستریدیوم پرفرانژنس به وجود نمی‌آید.

آزمایش دیگری كه برروی نمونه‌ها انجام شد آزماش كمپ – معكوس (Reverse-CAMP test) بود. باكتری كلستریدیوم پرفرانژنس تیپ A و باكتری استرپتوكوكوس آگالاكتیه بتا همولیتیک با یکدیگر الگوی سنیرژیستیک همولایتیک كمانی شكل تیپیک روی آگار خون‌دار ایجاد می‌كنند.

برای لاین منظور ابتدا باكتری كلستریدیوم پرفرانژنس احتمالی را به صورت یک خط روی محیط آگار خون‌دار كشت داده و سپس استرپتوكوكوس آگالاكتیه بتا همولیتیک به صورت خط عمود بر خط كشت نمونه مشكوک كشت داده شد، به نحوی كه باهم تلاقی نداشته باشند (با چند میلی‌متر فاصله). پلیت‌ها به مدت 24 تا 48 ساعت آنكوبه شدند. در موارد مثبت همولیزهای كمانی شكل مشاهده شدند.

آزمایش بعدی، آزمایش اوره آز بود. برای این منظور محیط استریل اوره تهیه شده و نمونه‌ها در آن كشت داده شدند و در شرایط بی‌هوازی و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 48 ساعت آنكوبه گردیدند. كلستریدیوم پرفرانژنس اوره آز منفی بوده لذا تغییر رنگ ایجاد نمی‌شود. آزمایش حركت نیز درمورد نمونه‌ها انجام شد. برای این منظور باكتری در لوله‌های حاوی محیط اوره كشت شد در صورت بروز كدورت و تولید گاز CO2 باكتری محرک تلقی گردید. لازم به ذكراست كه باكتری كلستریدیوم پرفرانژنس فاقد حركت می‌باشد.

در ادمه تست ایندول بر روی نمونه‌ها نیز انجام شد. باكتری كلستریدیوم پرفرانژنس ایندول تولید نمی‌نماید. برای تایید نهایی، نمونه‌های به دست آمده كه در آزمایشات قبلی مثبت بودند (ازنظر كلستریدیوم پرفرانژنس) برروی محیط (TSN (Tryptone Sulfite Neomycin agar آگار (Merck) كه محیط اختصاصی كلستریدیوم پرفرانژنس می‌باشد كشت داده شدند.

پلیت‌های كشت داده شده در شرایط بی‌هوازی به مدت 18 ساعت در 37 درجه سانتی‌گراد انكوبه گردیدند. بعد از طی مدت زمان مذكور درصورت وجود نتیجه مثبت كلنی‌هایی با هسته مركزی تیره رنگ مشاهده شدند كه بیانگر حضور باكتری كلستریدیوم پرفرانژنس بود.

مقاوت داروئی کلستریدیوم پرفرانژنس

تعیین الگوی مقاومت دارویی جدایه‌ها:

برای تعیین حساسیت 17 جدایه كلستریدیوم پرفرانژنس نسبت به داروهای ضد باكتریایی از آزمایش دیسک دیفوزیون به روش استاندارد (Kirby-Bauer) استفاده شد. محیط كشت انتخابی در این روش (Merck Mueller – Hinton) است كه رشد پرگنه‌ها را به صورت انفرادی و در كنار هم به طور رضایت‌بخشی فراهم می‌كند. شش عامل ضد باكتریایی مورد آزمایش و غلظت بالقوه آن‌ها (برحسب میكروگرم) عبارت بودند از: پنی‌سیلین، ونكومایسین، لینكومایسین، كلرامفنیكل، تتراسایكلین و نئومایسین كه همگی از شركت پادتن طب (ایران) تهیه شده است.

آزمایش برای هر 17 جدایه به شرح زیر انجام شد:

كلستریدیوم پرفرانژنس برداشت شده از محیط ذخیره Brain Heart infusion Broth) BHB) (آبگوشت مغز و قلب) روی محیط آگار خون‌دار كشت خطی داده شده و به مدت 24 ساعت در 37 درجه سانتی‌گراد در شرایط بی‌هوازی آنكوبه گردید. سپس 4تا 5 كلنی تک كلستریدیوم پرفرانژنس از محیط آگار خون‌دار برداشت شده و به یک لوله آزمایش درب‌دار حاوی 4تا 5 سانتی‌متر مكعب محیط BHB انتقال داده شد.

محیط تلقیح شده به مدت 2 تا 8 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و شرایط بی‌هوازی تا مشاهده یک كدورت واضح و قابل قبول با كدورت استاندارد 0/5 مک فارلند انكوبه گردید. سپس یک سواپ استریل به درون این سوسپانسیون باكتریایی وارد و مایع اضافی سواپ با فشار و چرخاندن به جداره داخلی لوله حاوی سوسپانسیون باكتریایی گرفته شد؛ سواپ به صورت خطی و بدون فاصله بین خطوط كشت برروی سطح محیط مولرهینتون آگار (ضخامت محیط كشت فوق 2 میلی‌متر بود) كه 20 دقیقه قبل از استفاده از یخچال خارج گردیده بود، كشت داده شد. به منظور تلقیح یکنواخت، كشت خطی سه مرتبه انجام شد. بدین نحو كه هر مرتبه پلیت حاوی محیط كشت به میزان 62 درجه نسبت به دفعه قبل چرخانده شده و مجدداً سواپ بر روی آن به صورت خطی كشیده شد.

در نهایت سر سواپ به لبه خلفی پلیت و در تماس با سطح محیط كشت چسبانده و یک دور كامل چرخانده شد. پلیت‌های تلقیح شده به مدت 3تا 5 دقیقه به همان حال باقی ماندند تا رطوبت اضافی قبل ازگذاشتن دیسک‌های آنتی‌بیوگرام توسط آگار جذب شود؛ سپس دیسک‌های مورد آزمایش كه 1ساعت قبل، به منظور رسیدن به درجه حرارت آزمایشگاه از یخچال خارج شده بودند توسط پنس استریل بر روی سطح محیط مولرهینتون آگار تلقیح شده قرارداده شدند.

به منظور رعایت فاصله بین دیسک‌ها بر روی محیط كشت به میزان 24 میلی‌متر از یكدیگر و 15 میلی‌متر از جدار پلیت فقط 6 دیسک بر روی یک پلیت 90 میلی‌متری گذاشته شد. ظرف مدت 15 دقیقه پس از دیسک گذاری، پلیت‌های جمع‌آوری شده و در وضعیت وارونه به مدت 16 تا 18 ساعت در 37 درجه سانتی‌گراد و در شرایط بی‌هوازی آنكوبه شدند؛ بعد از این مدت برای قرائت نتیجه آزمایش با استفاده از چشم غیرمسلح و در حضور نور متمركز، قطر‌هاله ممانعت از رشد هر ضد باكتریای بر حسب میلی‌متر توسط كولیس اندازه‌گیری شد و با جدول تفسیر قطر ‌هاله ممانعت براساس حساس و مقاوم طبقه‌بندی شدند.

نتایج:

تمامی‌ 17 جدایه كلستریدیوم پرفرانژنس در این بررسی نسبت به پنی‌سیلین، ونكومایسین و كلرامفنیكل حساسیتی از 79/5درصد تا 89‌درصد را داشتند؛ درحالی كه به تركیبات ضدباكتریایی تتراسایكلین، لینكومایسین، نئومایسین سولفات مقاومت دارویی از 71/3‌درصد تا 85/8‌درصد را نشان دادند. همچنین مشخص گردید تمامی جدایه‌ها به بیش از یک تركیب ضدباكتریایی مقاومت نشان می‌دهند (جدول 1).

همچنین مشخص شد كه 100‌درصد جدایه‌های كلستریدیوم پرفرانژنس به بیش از یک تركیب ضد باكتریایی مقاومت نشان دادند (جدول 2)

جدول شماره یک(1): درصد مقاومت دارویی 15 جدایه كلستریدیوم پرفرانژنس از مرغ گوشتی نسبت به 6 تركیب ضدباكتریایی

تركيبات ضدباكتريايي %جدايه هاي مقاوم % جدايه هاي نيمه حساس %جدايه هاي حساس
پني‌سيلين 20/5 0 79/5
ونكومايسين 10 1 89
لينكومايسين 71/3 4 24/7
كلرامفنيكل 0 18 82
نئومايسين سولفات 85 6 9
تتراسايكلين 81 10 9

بحث:

بیماری ورم روده نكروتیک به وسیله تكثیر باكتری كلستریدیوم پرفرانژنس تیپ A و C در روده كوچک ماكیان ایجاد می‌شود از طرفی دو تیپ مذكور در انسان سبب انتروتوكسین می‌شوند. كه این یک مشكل رایج در ماكیان بوده و به عنوان یک بیماری زئونوز مطرح می‌باشد. لازم به ذكر است كه از میان 1709 عامل بیماری‌زا 832 عامل زئونوز می‌باشد.

ورم روده نكروتیک در اروپا، آسیا و آمریكای شمالی در حال تبدیل شدن به یک بیماری عمومی است. در سال 1995، بیماری ورم روده نكروتیک 4درصد از بیماری‌های گزارش شده در فرانسه را شامل می‌شود كه در سال 1999 این رقم به 12/4‌درصد افزایش یافت.

 Devriese و همكاران طی سال‌های 1991 و 1992 حداقل غلظت مها ری 7 آنتی‌بیوتیک محرک رشد علیه 95 جدایه كلستریدیوم پرفرانژنس حاصل از طیور، خوک و گوساله را مورد ارزیابی قراردادند. همه این سویه‌ها به آنتی‌بیوتیک‌های بامبرمایسین، فلاوومایسین (فلاووفسفولیپول) مقاومت نشان داده‌اند ولی به آووپارسین، آویلامایسین و سالینومایسین حساس بودند.

مقاومت به تایلوزین و ویرجینیامایسین در بعضی جداره‌های حاصل ازتمام گونه‌ها بررسی شده، شناسایی گردید. دربررسی كه توسط Tansuphasiriu و همكاران در سال 2005 روی 201 جدایه كلستریدیوم پرفرانژنس جداشده از مدفوع انسان، خوک و غذا و سایر منابع محیطی (كه به وسیله PCR تایید شده بود) نسبت به 7 تركیب ضدباكتریایی انجام شد، مشخص گردید كه بیشترین مقاومت این جدایه‌ها به ترتیب در برابر تتراساكلین (56/2درصد)، ایمیپنوم (24/9درصد)، مترونیدازول (9/5درصد)، پنی‌سیلینG (حدود 9درصد) و ونكومایسین (4/5درصد)، كلرامفنیكل (3درصد) و سفتراكسون (1درصد) می‌باشد.

در مطالعه حاضر طیف و میزان مقاومت جدایه‌ها به تركیبات ضدباكتریایی گسترده و بالا بود به طوری كه جدای‌ای كلستریدیوم پرفرانژنس مورد بررسی بیشترین مقاومت را نسبت به 3 تركیب ضدباكتریایی نئومایسین سولفات با 85‌درصد تتراسایكیلین با 81‌درصد و لینكومایسین با 71درصد نشان دادند. همچنین كمترین مقاومت جدای‌ای كلستریدیوم پرفرانژنس نسبت به كلرامفنیكل با صفر درصد، ونكوماییسین با 9/8درصد و پنی‌ سیلین با 18/7درصد بود. Martel وهمكاران در سال 2002 در بررسی خود حساسیت جدایه‌های كلستریدیوم پرفرانژنس كه از روده طیور گوشتی از 31 مزرعه مختلف طیور گوشتی در بلژیک جدا شده بودند را نسبت به 12 تركیب آنتی‌بیوتیک كه برای درمان، تحریک رشد یا پیشگری از كوكسیدیوز به كار می‌رفت، ارزیابی نمود و نشان دادند كه جدایه‌ها به طور یكسانی به آنتی‌بیوتیک‌های یونوفوره از قبیل موننسین، لازولاسید، سالینومایسین، مادورامایسین و ناراسین حساس بودند.

جدول شماره دو(2): مقاومت چندگانه جدایه‌های كلستریدیوم پرفرانژنس از مرغ گوشتی نسبت به تركیبات ضدباكتریایی از مجموع 6 تركیب

درصد جدايه‌هاي مقاوم تعداد تركيبات ضد باكتريايي
100 1
100 >1
95 >2

در این مطالعه نیز درصد بالایی از مقاومت نسبت به بعضی از آنتی‌بیوتیک‌ها مانند: تتراسایكلین، لینكومایسین و نئومایسین و سولفات دیده شد. با این حال Johansson وهمكاران دریافتند كه مقاومت به تتراسایكلین در سویه‌های جدا شده از 3 كشور سوئد با 76‌درصد، دانمارک با 10‌درصد و نروژ با 29‌درصد و در 80‌درصد جدایه‌های مقاوم به تتراسایكلین (با روش PCR)  تعداد 2 ژن مقاومت (tetA(p) tetB(p شناسایی گردید و تنها در 20‌درصد جدایه‌های مقاوم به تتراسایكلین ژن(tetA(p ، وجود داشت. این درجات مقاومت به تتراسایكلین در جدایه‌های كلستریدیوم پرفرانژنس طیورگوشتی درسوئد درحالی بود كه میزان مصرف تتراسایكلین در طیور این كشور در كمترین مقداربود. با توجه به مقاومت داروئی بالای كلستریدیوم پرفرانژنس‌های جداسازی شده قبل از تجویز آنتی‌بیوتیک انجام آزمایش آنتی‌بیوگرام الزامی می‌باشد.

منبع: هفدهمین کنگره دامپزشکی ایران (اردیبهشت 1391)

علی قربانی رنجبری: دانشجوی دكترای دامپزشكی دانشگاه آزاداسلامی‌كازرون- ایران (عضو باشگاه پژوهشگران جوان دانشگاه آزاد اسلامی واحد كازرون)
علی قربانی رنجبری

رضا صدری پور: دانشجوی دكترای دامپزشكی دانشگاه آزاداسلامی‌كازرون- ایران

زهراقربانی رنجبری و نازنین قربانی رنجبری: دانشجوی شیلات دانشگاه علوم وفنون دریایی خرمشهر


نام:
پست الکترونیک:
نظر:
*
نظر شما با موفقیت ارسال شد.
نظر شما حداکثر تا 24 ساعت آینده بررسی می شود
ارسال نظر
نظرات حاوی توهین و افترا منتشر نخواهد شد
نظرات به زبانهایی به غیر از زبان فارسی منتشر نخواهد شد
نظرات غیر مرتبط با این خبر منتشر نخواهد شد.
نام:
پست الکترونیک:
نظر:
*