شناسایی جرم کوکسیلا بورنتی

به گزارش «سرویس دام، طیور و آبزیان» «ماکی دام - پایگاه خبری صنعت دام، طیور و آبزیان»؛ در مواقعی که سقط‌های پشت‌سرهم و یا مرده‌زایی در گله مشاهده می‌شود، جهت تشخیص آزمایشگاهی می‌توان از نمونه‌هایی چون جفت، ترشحات واژن و بافت‌های جنین‌های سقط شده (کبد، ریه یا محتویات معده) استفاده کرد.

همچنین برای بررسی دفع باکتری می‌توان نمونه‌ها را از واژن، شیر، آغوز و مدفوع دام تهیه نمود.

کوکسیلا بورنتی که یک باکتری درون سلولی اجباری است را می‌توان با تلقیح گونه‌های این باکتری به کشت‌های سلول معمولی، کیسه زرده جنین جوجه یا حیوانات آزمایشگاهی جداسازی نمود.

در مواردی که نیاز به جداسازی باکتری از بافت‌ها، مدفوع، شیر یا نمونه‌های محیطی که با میکروارگانیسم‌های مختلف آلوده شده‌اند داریم، استفاده از حیوانات آزمایشگاهی می‌تواند مفید واقع شود.

می‌توان باکتری را در بافت‌های رنگ‌آمیزی شده یا گسترش تهیه شده از موکوس واژن و با استفاده از میکروسکوپ روغنی با عدسی چشمی مشاهده نمود.

از آنجایی که این باکتری مقاوم به اسید است، می‌توان از روش‌های مختلف رنگ‌آمیزی از جمله استامپ، زیل نیلسن بهبود یافته، Gimenez و کوستر اصلاح شده استفاده نمود. البته به دلیل پایین بودن ویژگی این روش‌ها، نمی‌توان نتایج مثبت را به‌طور قطعی تأیید کرد.

تا امروز ثابت شده است که شناسایی جرم با استفاده از رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی، آمیخته‌گری درجا و PCR دارای ویژگی و حساسیت بیشتری نسبت به روش‌های رنگ‌آمیزی قدیمی دارند.

هیچ‌آنتی بادی اختصاصی برای روش ایمونوهیستوشیمی به‌صورت تجاری در دسترس نمی‌باشد. در حالی که کیت PCR برای نشخوارکنندگان موجود بوده و می‌توان به راحتی در آزمایشگاه‌های مناسب و مجهز از آن استفاده نمود.

همچنین PCR یک روش مفید و مطمئن برای غربالگری تعداد زیاد و انواع مختلف نمونه‌ها بوده و در حال حاضر یک ابزار انتخابی برای تشخیص بیماری تب کیو محسوب می‌شود.

اخیراً دو روش PCR-based typing توضیح داده شده است:

MST و (multi-locus variable number of tandem repeats analysis) MLVA

 (multispacer sequence typing)که بدون نیاز به جداسازی کوکسیلا بورنتی اجازه به تایپینگ گونه‌های جرم می‌دهد.

بر اساس نوع نمونه و هدف تشخیصی می‌توان کوکسیلا بورنتی را با روش‌های مختلفی شناسایی نمود. استفاده از real-time PCR جهت تشخیص و تعیین تعداد DNA کوکسیلا بورنتی، به‌طور چشمگیری کاربرد دارد.

در مواردی که سقط‌های پشت سرهم و مرده‌زایی در گله‌ای مشاهده می‌کنیم باید نمونه‌ها را از جنین‌های سقط شده، جفت و ترشحات واژن بلافاصله پس از سقط یا زایمان جمع‌آوری نمود.

همیشه در بررسی‌ها باید بتوان عامل اصلی سقط جنین در گله را مشخص کرد. تشخیص زود هنگام طوفان سقط ناشی از تب کیو در یک گله به ما کمک می‌کند تا بتوانیم با راه‌های آلودگی ازطریق دامداری یا محیطی مقابله کنیم.

زمانی می‌گوییم مورد مثبت در گله وجود دارد که علائم بالینی (سقط و یا مرده‌زایی) در آن گله مشاهده و حضور جرم تأیید شود. درصورت امکان، برای کاهش نتایج منفی کاذب در روش PCR لازم است نمونه سوآب واژن در روز زایمان (یا کمتر از 8 روز بعد از زایمان) جمع‌آوری شود.

در مواقعی که در تفسیر نتایج با مشکل مواجه می‌شویم، به‌کارگیری روش‌های سرم‌شناسی در گله می‌تواند مفید واقع شود. برای تشخیص دفع باکتری می‌توان از نمونه تانک شیر، نمونه‌های انفرادی شیر یا آغوز، نمونه‌های واژن و مدفوع استفاده کرد.

اما به‌هرحال شناسایی دفع‌کنندگان باکتری کار دشواری است، چراکه هنوز روش‌های انتشار جرم به‌خوبی شناسایی نشده‌اند.

آزمایش بر روی نمونه‌های تانک شیر یا مخلوط نمونه‌های انفرادی (مانند سوآب واژن و یا نمونه‌های شیر)، برای تشخیص انتشار داخل گله‌ای جرم باید صورت گیرد.

بیشتر بدانیم:
کلامیدوفیلا آبورتوس و سقط جنین دام
مکمل های معدنی برای میش های داشتی جهت بهبود سلامت بره و توان تولیدمثلی

الف) جداسازی جرم

برای تشخیص آزمایشگاهی اختصاصی جرم، ممکن است مجبور به جداسازی باکتری شویم.

در مواردی که بررسی‌های میکروسکوپیک تعداد زیادی کوکسیلا بورنتی را همراه با میزان کمی‌آلودگی با سایر باکتری‌ها نشان می‌دهند، جداسازی مستقیم با تلقیح به تخم‌مرغ جنین‌دار یا کشت سلولی امکان‌پذیر است.

به‌عنوان مثال، قسمتی از جفت را در بافر فسفات سالین (PBS) که حاوی آنتی بیوتیک (استرپتومایسین: μg/ml  200-100 و پنی‌سیلین یا جنتامایسین μg/ml 100-50) است، همگن‌سازی می‌کنیم.

پس از اینکه با سرعت پایین سانتریفوژ کردیم، مایع رویی رقیق را به تخم‌مرغ‌های جنین‌دار 7-6 روزه ازطریق کیسه زرده تلقیح می‌کنیم. بهتر است تخم‌مرغ‌های مربوط به مرغ‌های SPF را برای این کار استفاده کنیم.

جنین‌هایی که طی 5 روز اول پس از تلقیح تلف می‌گردند دور انداخته می‌شوند. 15-10 روز پس از تلقیح کیسه‌های زرده برداشت می‌شوند سپس گسترش‌های رنگ‌آمیزی شده از دیواره کیسه زرده جهت اطمینان از عدم آلودگی با سایر باکتری‌ها و شناسایی حضور کوکسیلا بورنتی بررسی می‌شوند.

همچنین می‌توان برای تشخیص این جرم از PCR نیز استفاده نمود. برای جداسازی جرم از یک کشت خالص، ممکن است پاساژ‌های بعدی نیز ضرورت یابد.

برای کشت ویروس، ظرف پوسته کشت سلول یک میکروکالچر سلولی به‌صورت تجاری موجود است و برای جداسازی باکتری‌های داخل سلولی مانند کوکسیلا بورنتی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

سوسپانسیون نمونه‌ها به فیبروبلاست‌های ریه جنین انسان (HEL) که در یک پوشش با ابعاد 1 سانتی‌متر مربع و داخل یک ویال پوشش‌دار رشد می‌کنند، تلقیح می‌شوند. سانتریفوژ کردن به مدت یک ساعت و با دور g 700 باعث افزایش اتصال و نفوذ پذیری باکتری به سلول‌ها می‌شود.

برای نمونه مشابه از سه ویال پوشش‌دار استفاده می‌شود. در روز 3، 10، 21، اثرات سیتوپاتیک کوکسیلا بورنتی (که به‌صورت واکوئل‌هایی مشخص می‌شود) با استفاده از میکروسکوپ معکوس بررسی می‌شود.

بعد از گذشت 10 روز، می‌توان کوکسیلا بورنتی‌های رشد کرده در سلول‌ها را به‌طور مستقیم با استفاده از آزمون ایمونوفلئورسنس بر روی پوشش داخلی در ویال پوشش‌دار شناسایی نمود.

در این آزمون از آنتی‌بادی‌های پلی کلونال ضدکوکسیلا بورنتی و آنتی بادی‌های ثانویه مناسب که متصل به ایزوتیوسیانات فلئورسئین هستند، استفاده می‌شود. باقی سلول‌های ویال پوسته برداشته شده و به فلاسک کشت 25 سانتی‌مترمکعب منتقل می‌شود.

با یک کشت معمولی که هفته‌ای یک بار تعویض می‌شود، گرم‌خانه گذاری به مدت 3 ماه انجام می‌پذیرد. بررسی بروز عفونت در سلول‌هایی که با Gimenez رنگ‌آمیزی می‌شوند و کشت رویی آنها سانتریفوژ شده و به وسیله PCR مورد ارزیابی قرار می‌گیرند، می‌تواند صورت گیرد.

هنگامی‌که اثرات ‌ سیتوپاتیک مشاهده شده و یا نتایج حاصل از رنگ‌آمیزی Gimenez یا PCR مثبت شود، یک پاساژ در فلاسک کشت 75 سانتی‌مترمکعب انجام می‌گیرد.

سپس جهت جداسازی کوکسیلا بورنتی، کشت رویی به لایه‌های یک پارچه سلول‌های ورو یا فیبروبلاست‌های L929  موش در فلاسک کشت 150 سانتی‌مترمکعبی تلقیح می‌شود. اگرچه این روش کاربرد انسانی دارد اما در مورد حیوانات نیز قابل استفاده می‌باشد.

در مواردی که نمونه‌های ما شامل جفت، ترشحات واژن، مدفوع یا شیر هستند که معمولاً به میزان زیادی با سایرعوامل آلودگی پیدا می‌کنند، تلقیح به حیوانات آزمایشگاهی به‌عنوان یک سیستم پالایشی ضرورت می‌یابد.

برای نگهداری جوندگانی که به‌طور تجربی آلوده می‌شوند، محدودیت زیستی در سطح 3 باید اعمال شود. موش و خوکچه هندی مناسب‌ترین حیوانات برای این کار هستند.

یک دز 0.5 میلی‌لیتری به‌صورت داخل صفاقی به هر حیوان تلقیح می‌شود و در این هنگام باید وضعیت دمای بدن و سطح آنتی‌بادی‌ها مورد بررسی قرار گیرد. انجام این روش باید با آزمایش‌های سرم‌شناسی (که از همان نمونه‌هایی که برای تلقیح به حیوانات مذکور استفاده شد باید استفاده گردد) همراه باشد.

نمونه‌های سرمی، 10 روز پس از تلقیح به موش و خوکچه هندی جمع‌آوری می‌شوند. اگر حیوان تب کند، می‌میرد و طحال آن جهت جداسازی جرم استفاده می‌شود، به این صورت که به تخم‌مرغ جنین‌دار یا کشت سلول تلقیح می‌شود. بررسی میکروسکوپیک کوکسیلا بورنتی را می‌توان با ایمپرژن و رنگ‌آمیزی طحال انجام داد. سپس می‌توان با انجام PCR بر روی نمونه طحال، DNA این باکتری را شناسایی کرد.

درمورد موش می‌توان طحال را 9 روز پس از تلقیح جمع‌آوری نمود.

ب) رنگ‌آمیزی

در مواردی که مشکوک به سقط عفونی هستیم، می‌توان گسترشی از کوتیلودون‌های جفت برروی لام‌های میکروسکوپیک تهیه نمود. همچنین برای این کار می‌توان از نمونه‌هایی چون ریه،کبد، محتویات شیردان جنین سقط شده یا ترشحات واژن استفاده نمود.

نمونه‌های فوق را می‌توان با روش‌های مختلفی مانند استامپ، Gimenez، ماکیاولو، گیمسا و کوستر اصلاح شده رنگ‌آمیزی نمود، که سه روش اول نتایج بهتری را در اختیار قرار می‌دهند.

روش‌های مذکور شباهت زیادی با روش زیل نیلسن بهبود یافته داشته و برای رنگ‌آمیزی باکتری، دارای فوشین پایه می‌باشند.

برای مثال رنگ‌آمیزی استامپ روشی است که در آن از 0/4 درصد محلول فوشین پایه استفاده می‌شود که به‌وسیله 0/5 درصد محلول اسید استیک به‌سرعت رنگ‌بری شده و سپس مجدداً با متیلن بلو 1% یا محلول مالاشیت گرین رنگ‌آمیزی می‌شود.

گسترش تهیه شده با استفاده از میکروسکوپ روغنی با عدسی چشمی‌ (500× یا بیشتر) مورد بررسی قرار می‌گیرد. در آزمایشگاه‌های دامپزشکی روش استامپ ترجیح داده می‌شود، در حالی که در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی بیشتر روش Gimenez جهت بررسی سلول‌های کشت آلوده، مورد استفاده قرار می‌گیرد.

از ‌ آنجایی که یک محلول اسیدی جهت تفریق استفاده نمی‌شود، روش Gimenez سریع‌ترین روش است. در رنگ‌آمیزی، کوکسیلا بورنتی به تعداد زیاد، باریک، به رنگ صورتی و کوکوباسیل در زمینه آبی یا سبز مشاهده می‌شود.

ممکن است به‌علت اندازه کوچک کوکسلا بورنتی، گاهی شناسایی آن‌ها دشوار باشد که به‌دلیل وجود تعداد بالای این اجرام حالت مذکور جبران می‌شود. گنجیدگی‌های این باکتری در سلول‌های میزبان، معمولاً به شکل توده‌های قرمز در زمینه آبی یا سبز مشاهده می‌شود.

باید توجه شود که ممکن است در تفسیر نتایج بررسی‌های میکروسکوپی، کوکسیلا بورنتی با کلامیدوفیلا آبورتوس و گونه‌های بروسلا اشتباه شود، اما کلامیدوفیلا آبورتوس حاشیه‌های مشخص‌تر دارد، گرد و کوچک بوده و شبیه گلبول‌ها است.

گونه‌های بروسلا نیز بزرگ‌ترند (μm 1/5-0/6 طول و μm 0/7-0/5 عرض)، واضح‌تر مشاهده می‌شوند و به میزان بیشتری رنگ می‌گیرند. برای مقایسه بین این سه باکتری، لازم است لام‌های کنترل مثبت برای کوکسیلا بورنتی، کلامیدوفیلا آبورتوس و بروسلا تهیه شود.

در روش‌های معمولی، بررسی‌های میکروسکوپی همراه با نتایج مثبت سرم‌شناسی کفایت می‌کند. اگر استفاده از رنگ‌آمیزی‌های بیولوژیک نتیجه بخش نیست، باید از روش‌های دیگر به عنوان آزمایش‌های تأییدی استفاده نمود.

ج) روش‌های تشخیصی اختصاصی

شناسایی کوکسیلا بورنتی را می‌توان با کمک روش‌های ایمنی‌شناسی اختصاصی (capture ELISA، ایمونوهیستوشیمی)، آمیخته‌گری in-situ یا تکثیر DNA انجام داد.

روش ایمونوهیستوشیمی می‌تواند با استفاده از بافت‌های آغشته به پارافین یا بر روی گسترش‌هایی که با استون ثابت شده‌اند، صورت پذیرد. این روش یک ایمونوفلئورسنس غیرمستقیم یا آزمون ایمونوپراکسیداز است که در آن از آنتی‌بادی‌های اختصاصی پلی کلونال کوکسیلا بورنتی که در حیوانات آزمایشگاهی (خرگوش یا خوکچه هندی) تولید می‌شود، استفاده می‌گردد.

جهت قابل مشاهده شدن باکتری، از یک antispecies (خرگوش یا خوکچه هندی) که به آنتی IgG (که با ATTC یا پراکسیداز نشان‌دار شده است) متصل شده است، استفاده می‌شود. باید لام‌های کنترل مثبت آنتی‌ژن کوکسیلا بورنتی جهت مقایسه موجود باشد.

هیچ آنتی‌بادی اختصاصی برای روش ایمونوشیمی به‌صورت تجاری موجود نمی‌باشد.

برای بافت‌هایی که آغشته به پارافین هستند (بخصوص نمونه‌های جفت)، از روش آمیخته‌گری in-situ فلئورسنس با استفاده از پروب‌های الیگونوکلئوتید اختصاصی که با هدف s rRNA 16 استفاده می‌شود.

روش PCR جهت شناسایی DNA کوکسیلا بورنتی در کشت‌های سلولی و نمونه‌های بیولوژیک، به‌طور موفقیت‌آمیزی استفاده می‌شود. PCR برای شناسایی گله‌های پاک یا گله‌هایی که در آن‌ها سقط رخ داده است طراحی شده است.

درمورد نمونه‌های شیر، آغوز و مدفوع که تعداد کوکسیلا بورنتی در آن‌ها نسبت به مواد سقطی کمتر است، می‌توان از روش PCR که برای نمونه‌های متنوعی طراحی شده است، استفاده نمود.

جهت حفظ ایمنی برای کارکنان آزمایشگاه، قبل از انجام PCR لازم است نمونه‌های بیولوژیک را غیرفعال سازیم، می‌توان این کار را با قرار دادن نمونه‌ها در دمای 90 درجه سانتی‌گراد به مدت 60-30 دقیقه (بسته به نوع نمونه، اندازه یا وزن آن) انجام داد.

این روش در آزمایشگاه‌های مجهز با استفاده از پرایمر‌هایی که برای اهداف متنوعی مشتق شده‌اند مانند توالی‌های الحاقی با چند کپی IS1111 (افزایش تعداد M80806) استفاده می‌شود.