جمع آوری نمونه جهت تشخیص بیماری مرزی

به گزارش «سرویس دام، طیور و آبزیان» «ماکی دام - پایگاه خبری صنعت دام، طیور، آبزیان و حیوانات خانگی»؛نمونه‌های قابل استفاده جهت تشخیص بیماری مرزی شامل؛ نمونه‌های بافت شناسی، نمونه‌های سرمی، نمونه‌های ویروس شناسی و... می‌باشد.

نمونه‌های بافت شناسی:

نمونه‌های بافت شناسی شامل پوست ثابت شده در فرمالین، نخاع، ½ مغز، پوست، تیروئید، قسمت انتهایی ایلیوم، کولون، سکوم، تیموس، طحال، کبد، قلب، کلیه می باشد. (جهت مشاهده با میکروسکوپ نوری و آزمایش ایمونوهیستوشیمی)

نمونه‌های سرمی:

نمونه‌های سرمی شامل سرم خون قلب، مایعات قفسه سینه (جهت آزمون خنثی‌سازی ویروس) می باشد

نمونه‌های ویروس شناسی:

این نمونه نیز شامل جفت/کارانکول، تیموس، گره‌های لمفاوی، طحال، تیروئید، مغز، ایلیوم و منی (ISO، آزمون فلئورسنت آنتی‌بادی، الایزا، PCR) می باشد.

نمونه‌ها جهت جداسازی ویروس

جفت و بافت‌های جنین

تعداد 5 یا 6 کوتیلودون جفت همراه با غشای بین کوتیلودون‌ها، بافت‌های جنین سقط شده و بره‌ای که تازه تلف شده باشد. این نمونه‌ها باید به‌صورت سترون (آسپتیک) و در ظروف سترون مخصوص (استریل) حاوی محیط کشت انتقالی ویروس جمع‌آوری شوند.

جدول شماره 8- نمونه‌هایی که جهت تشخیص بیماری مرزی باید جمع‌آوری شوند
علائم بالینی	روش‌های تشخیص	نمونه گیری از:
		دام زنده	دام تلف شده
سقط	جداسازی ویروس	نمونه خون هپارینه دام بالغ	تیروئید، کلیه، طحال، مغز، جفت در محیط کشت انتقالی(VTM)
	تشخیص آنتی‌ژن	نمونه خون هپارینه دام بالغ	تیروئید، کلیه، طحال، مغز، جفت
	بافت شناسی	__	مغز و نخاع در ثابت کننده
	سرم‌شناسی	نمونه خون دام بالغ	مایعات جنینی
بره با علائم بیماری، ضعف، با رشد کم یا دچار اسهال	جداسازی ویروس	نمونه خون هپارینه از بره و دام بالغ	تیروئید، کلیه، طحال، مغز، روده، گره‌های لمفاوی در محیط کشت انتقالی (VTM)
	تشخیص آنتی‌ژن	نمونه خون از بره و دام بالغ	تیروئید، کلیه، طحال، مغز، روده، گره‌های لمفاوی
	بافت شناسی	__	مغز و نخاع در ثابت کننده
	سرم‌شناسی	نمونه خون از بره و دام بالغ

نمونه‌های خون

نمونه‌های خون جهت جداسازی ویروس یا تشخیص وجود آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی استفاده می‌شود. بهتر است نمونه‌گیری از خون از میش‌های سقط کرده در زمان سقط جمع‌آوری شود.

نمونه خون از بره‌هایی که دارای علائم بیماری، ضعف، رشد کم هستند، باید قبل از مصرف آغوز جمع‌آوری شوند. از هر دام دو نمونه خون باید تهیه شود.

یکی از نمونه‌ها در لوله شیشه‌ای سترون که فاقد عوامل ضدانعقاد است جهت شناسایی آنتی‌بادی، نمونه دیگر در لوله شیشه‌ای سترون حاوی هپارین جهت جداسازی ویروس و شناسایی آنتی‌ژن جمع‌آوری می‌شود.

شناسایی آنتی‌ژن در نمونه‌های جفت و نمونه‌های بافتی از جنین سقط شده یا بره‌ای که با دارای علائم بیماری بوده و به‌تازگی تلف شده است انجام می‌گیرد. نمونه‌ها باید به‌صورت سترون (آسپتیک) جمع‌آوری شوند و در ظروف سترون قرار گیرند.

نمونه‌های بافت

نمونه‌های مغز و نخاع باید در ظروف شیشه‌ای حاوی ثابت‌کننده مناسب مانند فرمول سالین کلسیم (که با حل کردن 0/85 گرم سدیم کلرید و 1 گرم کلسیم کلرید در مخلوطی از 10 میلی‌لیتر فرمالدهید 40% و 90 میلی‌لیتر آب، به‌دست می‌آید) قرار گیرند و حداقل نسبت ثابت‌کننده به بافت 10 به 1 باشد.

نمونه‌های بافت باید حداقل به مدت 4 هفته در ثابت کننده باقی بمانند.

نمونه‌هایی که جهت تشخیص آنتی‌بادی جمع‌آوری می‌شوند:

• نمونه خون

• مایعات جنینی: محتویات شیردان، خون قلب، مایعات جنب و صفاق را می‌توان از جنین سقط شده‌ای که خیلی دچار هضم خود به خودی (اتولیز) نشده است برداشت کرد. این مایعات باید در اولین فرصت ممکن به صورت سترون جمع‌آوری شوند.

از سرنگ سترون برای این کار استفاده کنید و نمونه‌ها را در ظروف سترون و مناسب جمع‌آوری نمایید.

آماده سازی نمونه‌ها

• محیط کشت انتقالی:

محلول نمکی متعادل را hanks کنید

سرم آلبومین گاوی % 1

پنی سیلین G    300 IU/ml 

استرپتومایسین سولفات  00 μg/ml 

پلی میکسین B سولفات 150 IU/ml 

• آمونیوم کلرید tris 

آمونیوم کلرید 8/3 گرم

Tris     20/6 گرم

آب مقطر 1/9 لیتر

آمونیوم کلرید را در 1 لیتر آب حل کنید (0/16 مولار). Tris را در 900 میلی‌لیتر آب حل کنید (0/17 مولار) و pH را با استفاده از 1 مول اسید هیدروکلریک به 7/65 برسانید.

محلول کار: 90 میلی‌لیتر از آمونیوم کلرید 0/16 مولار را با 10 میلی‌لیتر از محلول tris با 0/17 مولار ترکیب و به‌خوبی مخلوط کنید و pH را با استفاده از هیدروکلریک اسید 1 مولار به 7/2 برسانید.

جداسازی ویروس

آزمایشگاه‌هایی که ویروس را جداسازی می‌کنند، باید ضمانت‌نامه‌ای داشته باشند مبنی بر اینکه سلول‌ها و سرم جنین گاو (FBS) فاقد آلودگی با پستی ویروس بوده و هیچ فعالیت ضدپستی ویروس ندارند.

می‌توان سلول را از تعدادی از سلول‌های کشت اولیه یا ثانویه گوسفند (مانند کلیه، بیضه‌ها و ریه)، جداسازی نمود.

رده سلول گوسفندی برای رشد BDV کمیاب است. رده سلولی نیمه مداوم از عضله جنین بره (FLM)، جنین، کامل یا شبکه کروئید گوسفند نیز قابل استفاده است اما رده‌های مختلف تفاوت قابل توجهی در آلودگی به ویروس دارند.

استفاده از سلول‌های گوسفندی برای جداسازی و رشد ویروس BD و BVD نوع 1 و 2 موفقیت‌آمیز می‌باشد. در مناطقی که گوسفند ازطریق گاو به BVD آلوده می‌شود، از سیستم جداسازی استفاده می‌شود که هم برای سلول‌های گاوی و هم برای سلول‌های گوسفندی مناسب باشد.

کشت سلول‌های مختلف گاوی می‌تواند مورد استفاده قرار بگیرد، ازجمله این سلول‌ها شامل سلول‌های بیضه، نای جنین یا توربینات‌های جنینی (شاخک‌های بینی جنین) یا یک رده ادامه‌دار حساس سلول کلیه می‌باشند.

به هرحال، سلول‌های گاوی برای جداسازی اولیه و رشد تعدادی از سلول‌های BD حساس نمی‌باشند. بنابراین اتکا به سلول‌های گاوی به‌تنهایی توصیه نمی‌شود.

می‌توان نمونه سرم را از دام زنده تهیه نمود و آن را جهت حضور ویروس عفونی مورد آزمایش قرار داد. اما شستن مکرر لکوسیت‌ها (حداقل سه مرتبه) در محیط کشت و کشت هم زمان آن‌ها به‌مدت 7-5 روز با سلول‌های حساس، حساس‌ترین روش برای تأیید عفونت پستی ویروسی است.

بافت‌های تهیه شده از دام‌های تلف شده، در محیط انتقالی ویروس { ((W/V 10%} جمع‌آوری می‌شوند. در آزمایشگاه، بافت‌ها سانتریفوژ شده، مایع رویی از فیلتر‌های 0/45 میکرون عبور داده می‌شوند و مابقی آن حذف می‌گردد.

طحال، تیروئید، تیموس، کلیه، مغز، گره‌های لمفاوی و جراحات روده، بهترین اندام‌ها برای جداسازی ویروس هستند.

می‌توان از منی جهت بررسی BDV استفاده نمود، اما منی بسیار سیتوتوکسیک است و باید رقیق شود (معمولاً  1/10 در محیط کشت).

خطر منی آلوده از قوچ‌های PI باعث شده است که خون نمونه بهتری برای شناسایی این، دام‌ها محسوب شود. روش‌های متنوعی جهت جداسازی ویروس وجود دارد که همگی آن‌ها باید حساسیت بالایی داشته باشند.

در زیر یک روش حساس برای جداسازی ویروس توضیح داده شده است:

کشت‌ها با subconfluent یا تک‌لایه‌های confluent جدید سلول‌های حساس گوسفندی حداقل دو مرتبه با محلول نمکی متعادل هنکس شسته می‌شوند. این کار برای حذف محیط رشد قبل از تلقیح با تقریباً با 0/2 میلی‌لیتر از نمونه، که باعث جذب سطحی به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد می‌گردد، انجام می‌شود.

i) کشت‌ها با حداقل 2 میلی‌لیتر محیط شسته و دور ریخته می‌شود، سپس یک حجم مناسب از محیط کشت نگه دارنده به آن اضافه می‌شود.

ii) کشت‌ها برای 7-5 روز در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گرم‌خانه گذاری می‌شوند، سپس با استفاده از میکروسکوپ به صورت روزانه بررسی شده و اثرات سیتوپاتیک در آن‌ها گزارش می‌شود.

iii) کشت‌ها در دمای 70 - درجه سانتی‌گراد منجمد شده و سپس ذوب شده و بر روی کشت‌های تازه پاساژ داده می‌شوند.

iv) از 3-4  روز بعد، سلول‌هایی که در فلاسک شیشه‌ای رشد می‌کنند، در استون سرد برای 15 دقیقه ثابت می‌شوند، اما سلول‌هایی که در فلاسک پلاستیکی رشد می‌کنند، به روشی که در آزمون خنثی‌سازی سرم استفاده می‌شود، ثابت می‌شوند.

سلول‌های ثابت شده، با استفاده از روش مستقیم یا غیرمستقیم ایمونوفلئورسنس رنگ‌آمیزی می‌شوند. کنترل‌های موردنیاز شامل سلول‌های منفی و سلول‌هایی که باعث رشد استاندارد سویه‌های سیتوپاتیک و غیرسیتوپاتیک BDV  می‌شوند، می‌باشد.

سلول‌ها با میکروسکوپ UV برای فلئورسنس سیتوپلاسمیک منتشر که پستی ویروس را مشخص می‌کند،  بررسی می‌شوند.

v) سلول‌ها زیر میکروسکوپ UV جهت آزمون فلئورسنس سیتوپلاسمیک منتشر (که پستی ویروس را تشخیص می‌دهد)، بررسی می‌شوند.

همچنین می‌توان از رنگ‌آمیزی ایمونوپراکسیداز روی cover-slipها و لام‌های chamber (همانند پلیت‌های میکروتیتر) استفاده کنید.

می‌توان برای کشت‌هایی که منجمد و سپس ذوب می‌شوند، از آزمون‌های الایزایی که آنتی‌ژن را شناسایی می‌کنند استفاده نمود، در این روش‌ها از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال علیه اپیتوپ‌های روی پروتئین 3-2 NS غیرساختمانی محفوظ، استفاده می‌شود.

رنگ‌آمیزی پستی ویروس‌های غیرسیتوپاتیک معمولاً ویروس را در پایان اولین پاساژ شناسایی می‌کند، اما برای شناسایی ویروس‌های کند رشد در سلول‌های ضعیف، باید دو مرتبه پاساژ داد.

آزمون‌های سرم‌شناسی

آنتی‌بادی‌های ضد BDV معمولاً با استفاده از آزمون خنثی سازی ویروس یا الایزا از سرم گوسفند شناسایی می‌‌شوند. می‌توان از آزمون آگار ژل ایمونودیفیوژن که از حساسیت پایین‌تری برخوردار است نیز استفاده نمود.

در تمامی آزمون‌ها باید از سرم‌های مرجع کنترل مثبت و منفی استفاده نمود، که در یک آزمون معتبر باید نتایج را در محدوده‌ای که از پیش تعیین شده است در اختیار ما قرار دهد.

سرم‌های انفرادی برای تشخیص شیوع BDV در یک گله، یک منطقه یا یک کشور مورد استفاده قرار می‌گیرند. به هرحال، برای تشخیص عفونت حاد، بهترین نمونه‌ها، سرم دام‌هایی که در مرحله حاد بیماری هستند و دام‌هایی که در مرحله نقاهت به سر می‌برند می‌باشند.

نمونه‌های سرمی که چند مرتبه از دام گرفته می‌شود، باید در کنار هم و در یک پلیت مورد آزمایش قرار گیرند.

کشت

برای نشخوارکنندگان، کشت‌های سلولی مختلفی وجود دارد. به‌دست آوردن نتیجه مطلوب از آن‌ها بستگی به نوع سلول و روش جداسازی دارد. یک واکسن تجاری BDV که حاوی دو سویه ویروس است، در رده‌های سلولی گوسفندی آماده شده است.

سلول‌ها باید با توجه به سیستم seed-lot از بذر سلول (MCS) master که عاری از آلودگی با میکروارگانیسم‌ها است، تولید شوند. واکسن فقط باید در سلول‌هایی که کمتر از 20 مرتبه پاساژ داده شده اند از MCS تولید شود.

سلول‌های کنترل باید در همه پاساژ‌ها ازلحاظ آلودگی به پستی ویروس، بررسی شوند.