به گزارش «سرویس دام، طیور و آبزیان» «ماکی دام - پایگاه خبری صنعت دام، طیور و آبزیان»؛ لپتین پروتئینی با 146 اسید آمینه و 16 كیلو دالتون جرم مولكولی است كه بطور عمده توسط بافت چربی سفید تولید می‌شود. لپتین عمدتاً در بافت چربی سفید و از 167 اسید آمینه ساخته شده و پس از جدا شدن 21 اسیدآمینه در داخل میكروزوم‌ها با طول 146 اسیدآمینه به داخل خون رها می‌شود. ارتباط مثبت بسیار قوی بینmRNA لپتین و سطوح پروتئین لپتین در بافت چربی و مقادیر لپتین خون وجود دارد. از آنجائی‌كه لپتین در مقادیر قابل توجه ذخیره نمی‌شود به نظر می‌رسد كه ترشح آن به طور پیوسته انجام می‌گیرد.
اثرات لپتین در سیستم‌های مختلف دربرگیرنده مسیرهایی است كه اشتها، مصرف انرژی و ترشح هورمونهای تولیدمثلی و متابولیكی را تنظیم می‌كنند. تارتاگلیا (1997) برای اولین بار گیرنده لپتین (Ob-R) را از موش به عنوان محصول ژن دیابت (db) جدا كرد. گیرنده لپتین واجد 6 ایزومر مختلف می‌باشد كه عبارتند از: Ob-Ra, Ob/Rb, Ob/Rc, Ob/Rd, Ob/Re , Ob/Rf.
تنها ایزوفرم Ob/Rbدارای بخش داخل سلولی طویل بوده و اجزاء لازم را جهت فعال ساختن سیگنال‌های داخل سلولی دارا می‌باشد، از این رو به عنوان ایزوفرم عملكردی 8 یا شكل بلند 9 شناخته می‌شود. مسیر JAK2/STAT مهمترین مكانیسم داخل سلولی لپتین می‌باشد. با این وجود، مسیرهای PI-3K و MAPKنیز در انتقال سیگنال دخیل می‌باشند.
لپتین به عنوان اندیكاتور ذخایر انرژی بوده و واسطه بالانس انرژی می‌باشد. لپتین با كاهش اشتها و افزایش تولید گرما از چاقی ممانعت می‌نماید. اما با توجه به این نكته كه میزان لپتین در پاسخ به وعده‌های غذایی افزایش نمی‌یابد، بعید به نطر می‌رسد كه به عنوان سیگنال سیری در كوتاه مدت عمل نماید. نقش لپتین در تنظیم وزن بدن ممكن است با سیگنال‌های متابولیكی دیگر نظیر انسولین و گلوكوكورتیكوئید‌ها همراه باشد.
با توجه به نقش‌های متنوعی كه به لپتین نسبت داده می‌شود می‌توان اندام‌های هدف مختلفی برای آن تصور نمود. به عنوان مثال، mRNA گیرنده عملكردی لپتین در بافت‌های چربی، عضله اسكلتی، كبد، كلیه، بیضه، دئودنوم، هیپوتالاموس و هیپوفیز گاو ردیابی شده است. لذا با توجه به اهمیت هورمون لپتین در متابولیسم و از آنجائی كه كبد به عنوان یک اندام موثر و مركزی در متابولیسم بدن دخیل است لذا مطالعه اخیر با هدف بررسی وجود یا عدم وجود گیرنده عملكردی لپتین در كبد گوسفند انجام شد تا مشخص شود آیا كبد گوسفند به عنوان یكی از اندام‌های هدف هورمون لپتین می‌باشد.
مواد و روش كار
برای جمع‌آوری نمونه‌های بافتی، با مراجعه به كشتارگاه صنعتی مشهد بلافاصله پس از ذبح گوسفند نمونه كبد اخذ گردید. نمونه‌ها در كنار یخ به آزمایشگاه منتقل شده و پس از خرد نمودن حدود 50 میلی‌گرم بافت به لوله‌های 1.5 میلی‌لیتری اپندورف منتقل گردید.
نمونه‌ها در فریزر 80- درجه سانتی‌گراد تا زمان استخراج RNA نگهداری شدند. استخراج RNA با استفاده از محلول (Roche) TRizol و بر اساس دستورالعمل شركت سازنده انجام شد. در مرحله پایانی جداسازی RNA، پلت RNA با 50 میكرولیتر آب RNase free آغشته به دی اتیل پیروكربنات گرم شده (60-55 درجه سانتی‌گراد) حل گردید.
به منظور حذف DNA ژنومی، از آنزیم دزوكسی ریبونوكلئاز I (DNase I) عاری از RNase استفاده شد. در مرحله بعد، واكنش رونوشت برداری معكوس برای تهیه cDNA با استفاده از 18(dT) Oligo و آنزیم رونوشت برداری معكوس (-M MULV) انجام گردید.
جفت پرایمرهای (Forward و Reverse) اختصاصی ژن‌های بتااكتین (ژن كنترل) و گیرنده لپتین بر اساس اطلاعات توالی موجود در بانک ژن طراحی شدند. پرایمرهای بتااكتین بر روی دو اگزون متفاوت طراحی گردیدند تا باند حاصل از تكثیر cDNA و DNAمتفاوت از یكدیگر باشد. در این صورت امكان آلودگی نمونه‌های DNA با cDNA ژنومی قابل تشخیص بود. نتایج حاصل از تكثیر cDNA بتااكتین قطعه 277 جفت بازی، و حاصل از تکثیر DNA بتااكتین 366 جفت بازی بود. واكنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاد از پرایمرهای طراحی شده و در حجم نهایی 25 میكرولیتر در طی 40 سیكل و با شرایط دمایی مناسب (5 دقیقه با دمای 95 درجه سانتی‌گراد جهت واسرشت، 45 ثانیه با با دمای 66 درجه سانتی‌گراد برای بتااكتین و 55/5 درجه سانتی‌گراد برای گیرنده لپتین جهت اتصال آغازگر به قسمت مكمل در الگو، 45 ثانیه با دمای 72 درجه سانتی‌گراد جهت طویل شدن آغازگرها و در پایان 10 دقیقه با دمای 72 درجه سانتی‌گراد جهت طویل شدن رشته‌های جدید) در دستگاه ترموسیكلر انجام شد.
محصولات واكنش PCR بر روی ژل آگارز 1/5درصد با استفاده از تانک الكتروفورز تفكیک شده و با استفاده از دوربین در زیر اشعه فراء بنفش قابل رویت گردیدند. باندهای بدست آمده با باند ماركر استفاده شده در ژل الكتروفورز مقایسه شد تا اندازه باندها مشخص شود.
نتایج و بحث
با استفاده از mRNA بتااكتین، به عنوان یک (Housekeeping gene) ژنی كه همیشه فعال بوده و در شرایط مختلف به
شکل 1- الکتروفورز قطعه حاصل از تکثیر cDNA بتااکتین (722 جفت بازی) بافت کبد. کبد مارکر 100M (خط2)، کنترل منفی (خط 2). جفت بازی DNA
شکل 2- بیان گیرنده عملکردی لپتین mRNA استخراج شده از بافت کبد با RNA از الکتروفورزRT-PCR استفاده از واکنش گیرنده لپتین (197 جفت cDNA قطعه بازی) تکثیر شده از بافت کبد (خط2) مارکر 100 جفت M کنترل منفی (خط1)
یک میزان بیان می‌شود، وضعیت كمی و كیفی RNAهای استخراج شده مورد ارزیابی قرار گرفت و پس از مشخص شدن وضعیت مطلوب كیفی و كمی RNA، واكنش PCR RT-PCR با استفاده از پرایمرهای مخصوص گیرنده لپتین انجام شد.
اگرچه جهت حذف آلودگی ژنومی‌در نمونه‌های RNA استخراج شده از آنزیم DNase I استفاده می‌شد، لیكن به منظور اطمینان بیشتر پرایمر بتا اكتین بر روی دو اگزون متفاوت طراحی گردید تا تكثیر از روی DNA نسبت به cDNA قطعه بزرگتری را تولید نماید. (داده‌ها نشان داده نشده). انجام واكنش RT-PCR با استفاده از پرایمرهای بتا اكتین cDNA سنتز شده از نمونه منجر به پدیدار شدن قطعه 277 جفت بازی گردید (شكل 1). این یافته به همراه عدم تكثیر قطعه 366 جفت بازی، نشانگر نبود آلودگی ژنومی در نمونه‌های RNA و همچنین كیفیت و كمیت مناسب RNA برای انجام مرحله بعد یعنی ردیابی mRNA گیرنده لپتین بود.
در مرحله بعد واكنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از پرایمر اختصاصی گیرنده لپتین انجام شد و آنالیز محصولات تكثیر شده بیان mRNA آن در كبد گوسفند را هماهنگ با مطالعه انجام شده در گاو تایید كرد.
(شكل 2). حال با توجه به بیان گیرنده لپتین در بافت كبد گوسفند، بایستی نقش‌های پاراكرینی/اتوكرینی آن در فیزیولوژی كبد گوسفند و اثرات متابولیسمی آن درتحقیقات آتی مورد توجه قرار گیرد.
منبع: هفدهمین کنگره دامپزشکی ایران، اردیبهشت 1391
نویسندگان:عباس ابویسانی ، حسام دهقانی: استادیار و دانشیار بخش فیزیولوژی، گروه علوم پایه، دانشكده دامپزشكی و عضو پژوهشكده بیوتكنولوژی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.
مرتضی زاهدی: دانشجوی كارشناسی ارشد فیزیولوژی، گروه علوم پایه، دانشكده دامپزشكی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران.