مطالعه مقاومت دارویی سالمونلاهای جداسازی شده از تخم مرغ های بومی شهرستان فسا (بخش دوم)

مطالعه مقاومت داروئی سالمونلاهای جداسازی شده ازتخم‌مرغ‌های بومی‌شهرستان فسا (بخش اول)

مواد و روش کار:

برای جداسازی باکتری سالمونلا، تعداد 200 عدد تخم‌مرغ از نواحی اطراف شیراز جمع‌آوری و به آزمایشگاه منتقل گشتند. در آزمایشگاه سطح پوسته تخم‌مرغ تمیز و با استفاده از اتانول 80 درصد ضدعفونی گشتند؛ پوسته آهکی با قیچی استریل شکسته ومحتویات هر 5 عدد تخم‌مرغ در یک بشر شیشه‌ای استریل مخلوط شدند؛ این مخلوط پس از 24 ساعت انکوباسیون در دمای 37درجه سانتی‌گراد با سوآب به محیط سلنیت_F به منظور غنی‌سازی تلقیح شد. برای مدت 24 تا 48 ساعت در  دمای 37درجه سانتی‌گراد مورد انکوباسیون قرار گرفت.

پس از خروج از انکوباسیون بر روی محیط کشت جامد سالمونلا – شگیلا آگار که حاوی پروتئین، لاکتوز، آهن، معرف NATRAL – RED می‌باشد به صورت سطحی کشت گردید.

محیط سالمونلا- شگیلا آگار برای مدت 24 ساعت در دمای37درجه سانتی‌گراد مورد انکوباسیون قرارگرفت، و سپس از نظر کلنی‌های مشکوک به سالمونلا بررسی شد، و درصورت منفی بودن نتیجه، انکوباسیون به مدت 24 ساعت دیگر ادامه پیدا می‌کرد.

نمونه‌هایی که پس از این مدت فاقد کلنی‌های مشکوک به صورت رنگ‌پریده یا زرد با مرکزی خاکستری وسیاه بودند منفی تلقی و حذف می‌شدند. سپس کلونی‌های نمونه‌های مشکوک را از محیط سالمونلا‌–‌ شگیلا آگار برداشته و به صورت سطحی وعمقی در محیط کشت TSI کشت داده شدند. پس از 24 ساعت انکوباسیون، کلنی‌های مشکوک به صورت آلکالاین/اسید یعنی بالا قرمز و پایین زرد بودند و در تمامی‌سالمونلاها بجز پاراتیفی A در محیط TSI ایجاد گاز H2S کرده که محیط TSI را به رنگ سیاه درمی‌آورد. همزمان تست LIA نیز انجام شد که سالمونلا‌ها تمام محیط را به رنگ ارغوانی درآوردند، همچنین از کلنی‌های مشکوک گسترش تهیه گردید که به روش گرم رنگ‌آمیزی شدند. چنانچه باکتری میله‌ای گرم منفی مشاهده می‌گردید از آن کشت خالص تهیه شده و براساس روش کوین وهمکاران (2002) برای وجود سالمونلا موردبررسی قرارمی‌گرفت.

شناسایی باکتری سالمونلا و سروتیپ‌های انتریتیدیس و سالمونلا تیفی‌موریوم به وسیله تست PCR

برای استخراج DNA از سالمونلاهای شناسایی شده فوق سوسپانسیونی ازکلنی در آب مقطر استریل تهیه گردید. سوسپانسیون به مدت 5 دقیقه در دمای 18 درجه سانتی‌گراد با سرعت 14000 دور در دقیقه سانتریفیوژ و از رسوب با روش فنل- کلروفرم ژنوم باکتری استخراج گردید. ژنوم با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن تهاجم (invA) برای شناسایی سالمونلاها مورد PCR قرار گرفت.

برای تعین سروتیپ، از پرامرهای ژن فیمبریا(sefA)، برای سالمونلاها انتریتیدیس و از پرایمرهای ژن ویریولانس (pefA) برای سالمونلا تیفی موریوم در  PCR استفاده گردید (جدول 1).

جدول 1: توالی‌های اولیگونوکلئوتید‌های مورد استفاده به عنوان پرایمر در واکنش زنجیره ای پلی مراز ‌(PCR)

نتایج و بحث:

در این تحقیق تعداد 200 تخم‌مرغ از نظر آلودگی به سالمونلا مورد بررسی قرار گرفتند. برای افزایش حساسیت جداسازی سالمونلاها، مرحله غنی‌سازی نیز قبل از تلقیح به محیط کشت انتخابی صورت می‌گرفت . از مجموع 40 نمونه مخلوط شده تخم‌مرغ‌ها تعداد 10 نمونه مخلوط در آزمایشات بیوشیمیایی و PCR دارای آلودگی به سالمونلا، از سروتیپ سالمونلا انتریتیدیس بودند.

محصول PCR بر روی ژل آگارز 1/5درصد الکتروفورزواز مارکر 100 جفت بازی برای تعیین وزن مولکولی قطعات DNA استفاده شد. رنگ آمیزی ژل با محلول اتیدیوم بروماید که یک رنگ فلوروسانس است انجام شد و از دستگاه تابش اشعه UV برای مشاهده باند‌های درخشان زیر نور ماورای بنفش استفاده گردید.

مطالعه مقاومت داروئی سالمونلاهای جداسازی شده ازتخم‌مرغ‌های بومی‌شهرستان فسا (بخش سوم)